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骨质疏松症以骨量减少、骨组织的微结构被破坏,导致骨强度下降、骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身骨骼代谢障碍性疾病。正常骨组织与其他组织一样存在着稳定的新陈代谢,即骨重建。正常情况下,骨吸收速度与骨形成速度大致相等,处于一种动态的平衡。当这种平衡被打破,骨吸收大于骨形成,就会导致骨质疏松。因此,抑制破骨细胞的功能或者促进成骨细胞的活性是治疗骨质疏松的重要手段。骨质疏松不仅给社会打来沉重的经济负担,也严重影响人们的生活质量和身心健康。市场上抗骨质疏松的药物主要分为两大类：抗骨吸收类药物和促骨形成类药物。目前临床以抗骨吸收类药物为主,主要有双膦酸盐、甲状旁腺素、选择性雌激素受体调节剂和活性维生素D及其同系物。遗憾的是目前具有促进骨形成作用的临床药物只有一个,甲状旁腺素(PTH1-34),而且有给药期限限制及较大的副作用。因此,开发高效的促进骨形成药物具有重大意义。研究表明肠源性血清素(Gut-derived serotonin, GDS)进入血液循环后,可以通过抑制成骨细胞的分化与增殖减少骨形成。因此,抑制肠源性血清素的合成可能有利于提高骨形成的速度。由于色氨酸羟化酶-1(TPH-1)是肠源性血清素合成的限速酶(将色氨酸转化为5-羟基色氨酸,即GDS的前体),因此开发TPH-1抑制剂调节血清素的合成可以作为骨质疏松症的一种崭新的治疗策略,TPH-1可以作为抗骨质疏松药物研发的靶标。本论文基于药物结构设计(Structure-based drug design, SBDD)的思路,虚拟设计了一系列基于熊果酸为母核的TPH-1抑制剂,并且对熊果酸衍生物与TPH-1的结合模式进行了预测,寻求最具抑制活性的结合位点。在此基础上合成了一系列熊果酸衍生物,并且对其体外和体内活性进行了探讨。一、熊果酸衍生物的设计在计算机设计系统指导下,以熊果酸为基础,结合自由能(ΔE)和抑制常数(Ki)为目标,通过Docking技术,对分子进行虚拟设计,得到理论上可以合成的化合物,虚拟构建了一系列新颖TPH-1抑制剂。二、熊果酸衍生物的合成在上述理论设计的基础上,我们首先采用较小位阻的缩合剂EDCI,在DMAP存在下与相应的酸反应,顺利得到目标产物la-d。然而当酸中含有吸电子基团时,产物除了可以在C-3进行酯化,并且可以直接将两分子熊果酸偶联在一起(1e-h)。在乙酸溶剂中加入乙酸酐和少量毗啶,回流条件下即可顺利制备酰基保护的熊果酸衍生物2。我们采用NaH2PO4/Na2HPO4/Na2WO4/H2O2体系对熊果酸的羟基进行氧化,制得关键中间体3,后处理方便、产率高、环境友好。在熊果酸A环引入吲哚的反应中我们采用Fischer吲哚化的方法,探索了三种不同条件对反应的影响。我们发现以乙酸为溶剂,使用肼的盐酸盐效果最好,制得(9-10),并且副产物较少。在另一个关键中间体4合成的过程中,我们先在冰浴条件下加入甲醇钠,再加入甲酸乙酯成功制得目标化合物4,并且此反应过程在氮气氛围下不需要酯基保护。而后,我们用胺和4在乙醇中回流反应顺利制得烯胺产物(5a-d)。我们用中间体4在金属钠存在条件下和醋酸甲脒或者盐酸苄脒反应制备嘧啶熊果酸衍生物,但是反应并未得到目标产物,而得到新的醛和醇缩合产物6,并且产率较高。中间体4与盐酸羟胺在乙醇中回流成功制得异恶唑熊果酸衍生物11。采用相同的条件可以用4与相应肼的盐酸盐在乙醇中反应制得吡唑熊果酸衍生物(13-15)。在异恶唑开环反应过程中,用过量的甲醇钠在CH3OH/Et2O混合溶剂中反应,然后在乙醇中加入当量的DDQ回流脱氢即可得到氰基熊果酸衍生物12。考虑到将C-2氰基转化为羧基,引入氢键供体基团,可能有助于活性的提高,我们采用NaOH在甲醇中回流过夜,反应结束后用浓盐酸酸化即可得到化合物26。值得注意的是,此步反应必须保证NaOH在甲醇中的浓度大于1 N,才可以完全反应。在熊果酸A环引入喹喔啉可以有多种途径,但是产率较低,副产物较多。因此我们先将3-羰基UA(3)氧化为2,3-羰基UA(16),再和邻苯二胺反应制得喹喔啉衍生物(17-18)。在氧化反应过程中由于二氧化硒具有较大的毒性,因此我们采用绿色氧化试剂(t-BuOK/t-BuOH)成功实现此步反应,并且优化了实验条件。得到的氧化产物16与邻苯二胺进一步反应得到喹喔啉衍生物,产率较高。将嘧啶环引入熊果酸母核是一个很大的挑战。我们先在熊果酸的C-2引入烯胺(7),然后再与醋酸甲脒在甲醇钠存在条件下于无水乙醇中回流反应制得目标产物19。使用无水LiI在DMF中回流脱除C-28酯基,加入少量正辛胺可以使反应更有效的进行,顺利得到目标产物20。我们在合成熊果酸杂环衍生物之后,也在C-28引入氨基酸或者其他杂环。我们先将C-28羧基转换为酰氯,再加入氨基酸酯及少量的三乙胺,成功制得目标产物。根据DOCK的结果我们猜测在化合11和12的C-28引入酰胺键可能会进一步提高其抑制TPH-1的活性,使用相同的条件我们在11和12的C-28引入了一系列具有代表性的胺(lld-n,12d-n).三、熊果酸衍生物的体外活性1.对血清素合成的抑制活性：我们采用HPLC方法检测我们合成的90个熊果酸衍生物在RBL2H3细胞(TPH-1表达细胞)中抑制肠源性血清素合成的能力,结合细胞毒性数据我们得到以下构效关系：(1)将熊果酸的C-3羟基酯化,即使将两分子熊果酸偶联在一起,其活性均没有明显提高(1a-h)；(2)将熊果酸C-3羟基氧化、乙酰基保护并不能引起活性的提高(2),但是在C-28引入氨基酸后其活性却明显增强(2a-b,3a-c),并且具有较低的毒性。但是引入苯丙氨酸甲酯到乙酰基保护的熊果酸母核上却不能促使活性提高(2c)；(3)将C-3羟基氧化后,无论在C-2引入氢键供体基团(Hydrogen bond donating groups)和氢键受体(Hydrogen bond acceptors)都不能引起活性的提高(5a-d,6,8,26)；(4)在熊果酸的A环引入异恶唑、吡唑、苯基毗唑、对氟苯基吡唑不能促使其活性的提高(11,13-18),吡唑或者含有氟片段吡唑熊果酸上引入氨基酸酯均可以引起其活性提高(13a-c,15a-c),并且毒性也较低。氨基酸酯引入其他吡唑或者异恶唑熊果酸衍生物都不能引起活性的提高·(lla-c,14a-c),同样的趋势出现在异恶唑开环后的熊果酸衍生物中(12,12a-c)；(5)在熊果酸的A环引入吲哚对活性提高没有影响(9-10),即使引入氨基酸酯其效果仍然不明显(9a-b,10a-c),奇怪的是在对氯吲哚熊果酸上引入苯丙氨酸甲酯后其活性明显提高(9c)；(6)在异恶唑或者异恶唑开环后的熊果酸衍生物C-28引入含有卤素、羟基的苯胺和苄胺、直链的胺都不能引起活性的提高(lld-e,111, 11n,12d-e,121,12n)。引入哌啶、吗啉等杂环均可以导致其抑制活性升高(11i-k, 11m,12i-k,12m),但是相应地其对细胞的毒性也明显增强。引入含有强吸电子或者强给电子基团的胺后其活性都有所提高(11g-h,12g-h),其中llg可以很大程度上抑制血清素的合成,达到79.3%,同时具有较低的毒性；(7)在熊果酸A环构建喹喔啉环可以使活性稍微提高(17-18),在喹喔啉熊果酸衍生物的C-28引入甘氨酸乙酯可以显著提高其生物活性(18a),并且毒性也比较低。但是引入其他氨基酸的酯或者在含有氯的喹喔啉熊果酸衍生物中引入氨基酸酯活性提高均不明显(17a-c,16, 18b-c,21),相似的结果出现在嘧啶熊果酸衍生物体系中(20,20a-c)；(8)喹喔啉熊果酸的C-28引入哌啶或者吗啉可以使其活性提高(22-25),但是其毒性也相应增强。因此,我们选取较高抑制活性,并且没有明显毒性的化合物11g、18a进行进一步研究。2.对TPH-1的抑制及相互作用结果表明,化合物11g、18a都可以抑制TPH-1蛋白及其mRNA的表达；并且大于其对TPH-2蛋白及其]mRNA的表达抑制,具有一定的选择性。利用SPR技术分析了化合物11g、18a与TPH-1的相互作用。结果表明化合物11g、18a都对TPH-1有特异性的识别能力。四、化合物11g、18a的体内活性用化合物11g、18a连续处理OVX大鼠30天后,可以发现11g、18a均可以明显降低血清中血清素的含量,并且没有显著影响脑中血清素的含量,这一点至关重要,因为脑中的血清素与肠中的血清素起相反的作用。由骨密度的数据可以发现在中高剂量时,11g、18a均可使骨密度、骨小梁数目、骨体积、骨小梁厚度增加,并且可以使骨小梁的间隙减小。说明用化合物11g、18a连续处理OVX大鼠一个月,可以明显防止由摘除卵巢引起的骨流失。此外,大鼠摘除卵巢后其骨转换速度加快,ELISA分析结果表明化合物11g、18a都可以使血清中骨形成标记物PlNP(N-terminal propeptide of procollagen type 1)的浓度升高,但是对血清中骨吸收标记物CTX-1(Carboxy terminal telopeptide of collagen type I)的量没有明显的影响,这说明化合物11g、18a都可以通过促进骨形成的方式防止OVX大鼠骨流失。以上这些结果表明化合物11g、18a是通过促进骨形成防止骨流失,值得进一步研究。从药物安全性角度考虑我们验证了化合物11g、18a是否具有雌激素作用和肝毒性,切片实验结果表明即使最大给药剂量组大鼠子宫萎缩,说明化合物11g、18a均没有明显雌激素样副作用。肝脏切片结果也表明化合物11g、18a不具有明显的毒性。总之,化合物11g、18a可以在体内通过抑制血清素的合成防止骨流失,是值得深入研究的先导化合物。