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恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病,目前尚无满意的治疗措施。海洋生物是新药的丰富资源,其中抗癌药物在海洋药物研究中一直起着主导作用。
CU306是从黑乳海参中提取出来的一种新的三萜皂苷,经体外抗肿瘤活性实验、体内小鼠移植瘤药效实验以及体外新生血管生成抑制实验,初步显示该化合物具有肿瘤杀伤兼新生血管生成抑制的双重作用,是一种新类型的抗肿瘤新药。但CU306静脉注射具有强烈的溶血作用,对心脏、肾脏具有很强的刺激作用,普通的静脉注射剂无法直接应用于临床；若口服,在胃肠道内易被水解和酶解,生物利用度极低；其它给药途径如肌注等又同样存在刺激性等问题,而且难以通过制剂学手段靶向于肿瘤器官或细胞。
本研究的主要目的在于利用脂质体具有靶向和降低药物毒性、溶血性的优点,拟通过制剂学手段降低CU306的毒副作用和溶血作用,将其制备成稳定、安全、有效的静脉注射用脂质体冻干剂,为开发申报拥有自主知识产权的抗肿瘤一类新药奠定基础。
本文系统探讨了脂质体作为给药载体降低CU306溶血性和毒性的可行性和机理,并对其产生影响的处方组成因素进行了研究,采用冻干法保证了制剂贮存过程中的稳定性；研究了药物与脂质体膜材之间的相互作用,探究了其包封率高的原因,并为后续的药动、药效研究奠定基础；研究了该给药体系对于药物动力学及组织分布学等方面的影响,并通过急性毒性试验验证脂质体制剂有无降低毒性的作用。
建立了HPLC-ELSD测定CU306含量和微柱离心法测定脂质体包封率的方法,考察了CU306在不同pH值缓冲液中的稳定性和油水分配系数。结果表明:CU306在pH值3.0-9.0范围内较为稳定。CU306的logP值小于-0.3,属于水溶性特别好的药物,有可能比较容易形成理想的脂质体。
以包封率、粒径和溶血率为考察指标,考察了薄膜分散法和逆相蒸发法两种制备方法,确定采用薄膜分散法制备CU306脂质体。采用薄膜分散法,单因素考察了磷脂浓度、胆固醇浓度、脂药比以及水化介质对包封率、粒径和溶血率的影响,结果磷脂浓度、胆固醇浓度、脂药比对考察指标影响较大,并且因素之间存在明显的交互作用,因此进一步采用中心组成设计优选处方,采用效应面优化法对中心组成设计所建立的二次多项式模型进行优化。优化后的CU306脂质体的制备工艺为采用薄膜分散法；磷脂与胆固醇比例为2:0.9(W/W);脂药比定为40:1(W/W)。按照优化工艺制备三批CU306脂质体,对其包封率、粒径、体内外溶血性进行了初步考察。
测定结果表明：其平均包封率为98.1％：平均粒径为89.1 nm;体外溶血率较CU306溶液大大降低,80 μg·mL-1浓度时溶血率<1％；体内溶血实验的初步考察结果显示CU306脂质体静脉注射后体内溶血行为也大大降低。为了保证脂质体贮存过程中的稳定性,将脂质体制备成冻干粉。通过对冻干保护剂的筛选和冻干工艺的优化,确定采用双糖类物质蔗糖为冻干保护剂,冻干保护剂与脂质的比例为5:1。确定CU306脂质体的冻干工艺为：冷凝器温度为-70℃,预冻时搁板温度为-55℃,预冻时间为5 h,干燥过程按照渐进升温的方法,干燥时间确定为30h。在该条件下CU306冻干脂质体外观饱满致密,再分散性好,冻干前后脂质体的粒径、Zeta电位、包封率、电镜下形态以及含量均没有发生明显变化。按照药典规定,对CU306脂质体冻干粉进行了溶血和凝聚检查试验,结果在规定的剂量和时间未发生溶血和凝聚现象。与葡萄糖注射液的配伍试验表明CU306脂质体冻干粉用葡萄糖注射液稀释一定倍数,8 h内粒径、包封率、溶血性变化均无明显变化。
加速稳定性试验结果表明CU306脂质体冻干粉在温度为25℃±2℃、相对湿度为60％±10％的条件下放置6个月较为稳定。外观、含量、包封率、粒径、pH值等重要指标未发生明显变化。
采用傅立叶红外、差示扫描量热法、和荧光试验法研究了CU306与脂质体膜材的相互作用。研究结果表明:CU306与脂质体膜材中磷脂、胆固醇之间具有一定的相互作用,这是其包封率高的主要原因,也是脂质体维持稳定的原因。磷脂与胆固醇之间有一定的相互作用,但在CU306的存在下,磷脂与胆固醇某些基团的相互作用消失,可能由于药物与胆固醇之间的作用更强,抢占了与磷脂作用的基团。胆固醇混悬液可以降低CU306分子的溶血行为,起作用的不仅有溶解在水中的少量胆固醇分子,还有混悬在水中的胆固醇固体微粒,但与脂质体相比,抑制同等量药物的溶血行为所需要的胆固醇更多,结合时间更长,必须与药物混合放置24 h以上方能较为完全的结合,充分说明了脂质体作为载体抑制CU306溶血的优势。
建立了大鼠全血和组织中CU306含量测定的LC/MS/MS方法。为了探讨脂质体与药物溶液在体内行为的区别,进行了CU306溶液组和脂质体组在体内的全血药物动力学和组织分布学研究,结果两种制剂静脉注射后AUC以及各药动学参数之间无统计学意义,其大鼠体内药物动力学过程均符合三室模型。脂质体注射后由于其天然靶向性,与溶液剂比较,在网状内皮细胞较为丰富的器官肝脏和脾脏的分布明显增加,而在肺、肾、心的蓄积大大减少。因此可以降低CU306对心脏和肾脏的毒性,并可能增强其治疗肝癌的效果。通过小鼠静脉注射CU306溶液或CU306脂质体,观察两者所产生的毒性反应并测定了半数致死量,结果表明:CU306脂质体相对于溶液组,LD50提高了一倍以上(分别为9.5mg/kg和4.1 mg/kg),其急性毒性明显下降,说明CU306制备成脂质体后,起到了降低溶血毒性和其他毒性的作用。