【摘 要】
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目的：观察大鼠心肌组织缺血-再灌注不同时间DR的表达规律及其意义；DR活性变化在缺血-再灌注损伤诱导新生乳鼠心肌细胞凋亡中的作用及信号传导途径。 方法：采用Lagendorff离体
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目的：观察大鼠心肌组织缺血-再灌注不同时间DR的表达规律及其意义；DR活性变化在缺血-再灌注损伤诱导新生乳鼠心肌细胞凋亡中的作用及信号传导途径。
方法：采用Lagendorff离体心脏灌流的方法复制心肌缺血-再灌注损伤模型；乳鼠心肌细胞以缺氧、缺血清培养2h,复氧、复血清培养24h的方法建立心肌细胞缺血-再灌注损伤模型。(1)采用RT-PCR和Western blot检测不同时间缺血-再灌注损伤大鼠心肌组织DR1、DR2的mRNA和蛋白质的表达变化。(2)采用RT-PCR和原位杂交技术,观察应用多巴胺受体激动剂和抑制剂等药物干预后,细胞中Bcl-2、FaS、Faus-L、caspase-3、caspase-8和caspase-9的mRNA表达。(3)用Western blot和免疫荧光技术检测Bcl-2、Fas、Fas-L、caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白质的表达。(4)用Western blot检测心肌细胞DR1、DR2及细胞色素C(Cyt c)蛋白质的表达。(5)应用激光共聚焦显微镜(LSCM)观察心肌细胞在受到各种刺激后,细胞内钙的变化。(6)用TUNEL、流式细胞仪、MTT检测心肌细胞凋亡情况。(7)借助紫外分光光度计,检测心肌组织匀浆、冠脉流出液和细胞培养液中LDH、SOD活性和MDA含量。(8)用光镜和透射电镜观察心肌细胞形态变化。
结果：1、整体水平：(1)大鼠心肌组织DR1、DR2 mRNA和蛋白的表达在缺血1h和再灌注1h时表达增加,再灌注2h达高峰,再灌注3h、4h后降低。(2)心肌缺血-再灌注过程中,冠脉流出液中LDH活性和心肌组织匀浆中MDA含量增加,且再灌注2h达高峰；心肌组织匀浆中SOD活性降低,且再灌注2h达最低。(3)心肌缺血.再灌注时,心肌损伤严重。 2、细胞水平：(1)模拟缺血-再灌注损伤组,细胞DR1和DR2蛋白表达明显增加。(2)与正常组比较,模拟缺血-再灌注组细胞培养液中LDH活性和MDA含量增加,SOD活性降低；心肌细胞凋亡指数增加；心肌细胞超微结构损伤加重；促凋亡因子(Cyt c、Fas、Fas-L、caspase-3、caspase-8、caspase-9)表达增加,抑凋亡因子(Bcl-2)表达亦增加；细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)升高。(3)与缺血-再灌注组比较,10μmol/L SKF-38393(DR1激动剂)进一步增加LDH活性和MDA含量,降低SOD活性；增加心肌细胞凋亡指数：加重心肌细胞损伤；上调促凋亡因子表达,下调抑凋亡因子表达；增加[Ca2+]i浓度；而10μmol/L,Bromocriptine(DR2激动剂)则表现出与SKF-38393相反的作用；10μmol/LSCH-23390(DR1抑制剂)和10μmol/L Haloperidol(DR2抑制剂)对上述指标影响不明显。
结论：(1)在离体大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型中,DR1和DR2的表达呈缺血期增加,再灌注早期进一步增加而后期降低的特点,说明其可能参与心肌缺血-再灌注损伤的发生。(2)在模拟缺血-再灌注损伤的细胞模型中,DR1和DR2在再灌注期的表达明显增加,DR1激活可促进细胞凋亡,其机制与增加细胞内钙超载、上调线粒体途径和死亡受体途径有关；DR2激活则可抑制细胞凋亡,其机制恰与DR1激活时相反。
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