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水稻(Oryza sativa L.)是全球近半数人口最主要的粮食作物,而其产量经受着大量病原微生物或昆虫的严重威胁,通过利用植物抗病基因(R基因)培育抗性品种被认为是最经济有效的应对措施,迄今在水稻中已经成功克隆了20个R基因,所有这些R基因都是通过品种间的抗性差异筛选鉴定的,但有关这些尺基因介导水稻抗病防御反应的分子机制仍然知之甚少。通过对本实验室构建的粳稻日本晴背景的大规模T-DNA插入突变体库的筛选,我们鉴定到一个不完全显性、营养生长期叶鞘特异性自主坏死的突变体nls1-1D。最初鉴定到的nls1-1D是一个杂合态的突变体,而相应的纯合突变体表型严重,在萌发3周后生长停滞并最终死亡。进一步详细的表型分析发现,在杂合型nls1-1D突变体整个生长周期内,自主性坏死斑主要以发育依赖的方式出现在叶鞘和种壳上,同时这种自主性坏死斑的形成非常类似于植物抗病防御反应过程中出现的超敏反应(hypersensitive response)。此外,我们还从γ射线诱导的粳稻中花11背景的突变体库中鉴定到一个表型类似的等位突变体nls1-2D。
通过图位克隆方法,我们鉴定到相应的基因.Nls1,该基因编码典型的CC-NB-LRR类R蛋白。进化树分析表明NLS1与谷类作物中的多个抗病蛋白具有最近的亲缘关系。互补和RNA干扰实验进一步确认Nls1的功能获得性突变导致了突变体特定组织细胞的自主死亡。与突变体坏死斑形成的模式较为一致的是,Nls1基因在叶鞘上有最高水平的表达,且这种表达同样是发育依赖的。另一方面,在没有出现坏死斑的其他组织同样检测到Nls1相对低水平的表达,表明Nls1可能在特定组织激活特定的抗病防御信号途径从而导致细胞死亡。
nls1-1D和nls1-2D的突变均在CC-NB-LRR类R蛋白NLS1的NB结构域上引起了单个氨基酸的替换。随着NLS1这一R蛋白的序列改变,nls1-1D突变体植株内积累了高水平的水杨酸(SA,salicylic acid),组成性诱导了抗病相关基因的表达,同时提高了对水稻白叶枯病原菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)的抗病性。与此同时,尽管nls1-1D突变体上坏死斑的表型与其体内Nlsl转录本的大量积累有着一定的相关性,但是过表达野生型Nls1基因并不能诱导自主性坏死斑的形成和抗病相关基因PR1b的表达,且没有改变对Xoo病原菌的抗性,表明突变体的表型并非简单的是由Nls1的过量表达所引起。由此我们认为nls1-1D和nls1-2D的突变所引起的单个氨基酸替换导致了NLS1蛋白自主性的激活。
为了探讨nls1-1D植株中SA的高水平积累是否是下游抗病防御途径激活的必需步骤,我们在野生型和nls1-1D杂合突变体中表达了细菌SA水解酶基因NahG,从而获得了相应的SA缺失的转基因植株。通过对这些转基因植株的分析表明nls1-1D中SA的高水平积累一定程度上有助于保护植物免于氧化胁迫。但Nls1介导的抗病防御反应并没有受到SA含量变化的影响。与此类似的是Nls1介导的抗病防御反应同样没有受到NPR1表达下调(RNAi)的影响。基于这些结果,我们认为Nls1通过不依赖于SA和NPR1的信号传递途径来激活下游的抗病防御反应,从而引起突变体一系列抗病相关的表型。