论文部分内容阅读
猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus,PCMV)是一种有囊膜的双股线性DNA病毒,可以导致胚胎死亡、仔猪鼻炎、矮小、肺炎和增重缓慢等症状,成年猪一般呈隐性感染,不表现临床症状。PCMV主要蛋白有糖蛋白B、衣壳蛋白和DNA聚合酶蛋白。gB蛋白是PCMV的必需糖蛋白和重要免疫原,在病毒侵染宿主细胞的黏附、融合和进入细胞以及在细胞问的转移过程中发挥重要作用,同时gB蛋白作为主要的保护性抗原,可以诱导机体产生特异性免疫应答。本研究通过基因重组技术获得重组gB蛋白,将纯化的gB蛋白为包被抗原建立了间接ELISA方法,用于PCMV抗体的检测和血清学调查。同时,将gB蛋白免疫小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备gB蛋白的单克隆抗体,为PCMV诊断和致病机理的研究奠定基础。具体内容如下：1.猪巨细胞病毒gB基因原核表达与鉴定采用PCR方法从PCMV阳性组织病料中扩增gB基因,将其克隆至pET-32a载体。将鉴定正确的重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中,涂板挑选阳性单个克隆菌。经IPTG诱导表达后收集菌液进行SDS-PAGE电泳,原核表达产物大小约为40KDa。表达产物经Western-blotting分析,表达的蛋白能够与His-Tag单克隆抗体反应,也能被猪抗PCMV-gB蛋白血清所识别。试验结果表明,PCMV-gB基因在大肠杆菌中高效表达且表达产物具有抗原性。2.猪巨细胞病毒间接ELIS检测方法的建立与初步应用用纯化的gB蛋白包初(?)ELISA酶标板,建立间接ELISA抗体检测方法,对各项反应条件进行优化,并确定其临界值,同时进行特异性、敏感性及重复性试验。优化反应条件为：抗原最适包被量为0.4μg/ml,待检血清稀释度为1：100,37℃作用1h,包被时间为37℃作用2h,然后4℃过夜,5%脱脂乳37℃封闭2h,二抗1：10000稀释,37℃作用1h,临界值为OD450nm≥0.354判为阳性,OD450nm≤0.295判为阴性,介于二者之间为可疑。与猪瘟,猪伪狂犬病,猪附红细胞体病,副猪嗜血杆菌及猪2型圆环病毒等血清抗体无交叉反应,批间和批内重复性试验较好,对江苏省259份仔猪血清样品进行检测,抗体阳性率达56.76%,为PCMV诊断和流行病学调查提供了有效工具。3.抗猪巨细胞病毒gB蛋白单克隆抗体的研制以原核表达的重组猪巨细胞病毒gB蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术进行融合,间接ELISA抗体方法筛选,获得了8株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6C2、6H9、8B5、1E7、3C9、3F6、3F11和5G10。其细胞上清ELISA抗体效价为1：800～1：3200,腹水效价为1：2.048×105～1：8.196×106；单抗的亚类鉴定结果为：6C2、6H9和8B5为IgG2b亚类,1E7、3C9、3F6、3F11和5G10均为IgG1亚类,8株单抗轻链均为κ型；Western-blotting鉴定表明获得8株单克隆抗体能够与原核表达的gB蛋白反应,但是只有6C2和6H9两株单抗能够识别真核表达的gB蛋白,说明这两株单抗具有良好的反应性。综上所述,本研究利用重组gB蛋白建立了PCMV间接ELISA抗体检测方法,同时制备了gB蛋白的单克隆抗体,为PCMV血清学诊断、流行病学调查及致病机理的研究奠定基础。