论文部分内容阅读
研究目的：
为了深入研究长链非编码RNA与肝脏细胞脂质代谢之间的关系,通过lnc-RLM对肝脏细胞脂质沉积的影响，并对相关作用机制进行了初步探索。
研究方法：
1.Lnc-RLM的生物信息学特征
利用UCSC（http://genome.ucsc.edu/）数据库对lnc-RLM进行基因组定位以及物种间保守性分析；利用ORFFinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测lnc-RLM的潜在开放阅读框，并利用UCSC数据库比对开放阅读框编码可能性；运用CPAT（CodingPotentialAssessingTool）软件和CNCI软件分别分析lnc-RLM、lncRNAH19和GAPDH的编码能力；利用RNAfoldwebserver（http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）预测lnc-RLM二级结构。
2.Lnc-RLM的全长以及细胞定位
运用RLM-RACE和PCR对lnc-RLM进行全长扩增，通过胶回收、TA克隆、菌液PCR等实验挑选出含有目的序列的单克隆菌落，样本送上海桑尼生物科技有限公司测序，利用UCSC数据库进行序列比对。制备HepG2细胞细胞爬片，利用荧光原位杂交试剂盒（RiboTMFlourescentInSituHybridization）进行HepG2细胞中lnc-RLM原位杂交，激光共聚焦显微镜下观察HepG2细胞中lnc-RLM定位。
3.利用阳离子脂质体转染siRNA，分别降低HepG2细胞和Huh7细胞中lnc-RLM表达量，进行以下实验（HepG2细胞和Huh7细胞中实验方法相同，均以HepG2细胞为例）：
（1）分别检测HepG2细胞和Huh7细胞中甘油三酯含量
根据甘油三酯可在一系列酶的作用下，与对氯酚反应生成红色醌化物的原理，利用南京建成生物工程研究所甘油三酯（TG）测定试剂盒，检测细胞中甘油三酯含量。
（2）油酸刺激细胞24h后检测细胞中总甘油三酯含量
HepG2细胞加入400μM油酸刺激细胞24h,收集细胞，利用南京建成生物工程研究所甘油三酯（TG）测定试剂盒，检测细胞中甘油三酯含量。Huh7细胞中油酸浓度为500μM。
（3）油红O染色检测HepG2细胞和Huh7细胞中脂质分布
根据脂溶性染料油红O可在脂肪内能高度溶解，并能够特异使组织内甘油三酯着色的原理，在细胞处理完成后，利用倒置显微镜下观察细胞中脂质分布情况。
（4）HepG2细胞和Huh7细胞中检测乙酰辅酶A羧化酶（ACC）活性
细胞处理后，根据ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3、ATP生成丙二酰辅酶A、ADP和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量反应ACC活性的这一原理，检测细胞中ACC活性。
4.利用用qPCR及WesternBlot检测相关基因与蛋白的表达量。
利用阳离子脂质体转染siRNA，降低HepG2细胞中lnc-RLM表达量，收集细胞，提取RNA，利用Takara逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，根据南京诺唯赞生物科技有限公司PlatinumSYBRGreenqPCRSuperMix-uDGwithROX使用说明书，配制荧光定量PCR反应体系，设置相应反应条件，利用BioradCFX96Real-TimePCRSystem进行PCR扩增。检测脂质代谢相关基因（AMPK、SREBP-1c、FAS、ACC、PPARγ、HMGCR、PGC-1α）mRNA表达量。细胞处理后，通过WesternBlot实验检测脂质代谢相关基因（AMPK、SREBP-1c、FAS）蛋白水平表达量
5.A-769662刺激细胞24h，WesternBlot检测相关基因蛋白水平的表达量。
敲低HepG2细胞和Huh7细胞中lnc-RLM表达量，分别用不同浓度AMPK激动剂（A-769662）刺激细胞24h，收集细胞，提取总蛋白，WB实验检测脂质代谢相关基因蛋白质水平表达量。
研究结果：
1.Lnc-RLM位于人类12号染色体长臂23.1区域，含有一个外显子，拥有众多茎环结构，二级结构复杂，无蛋白质编码潜能。
2.Lnc-RLM全长1750nt，定位于细胞质内。
3.干扰lnc-RLM可以促进HepG2细胞和Huh7细胞中的脂质沉积。
利用阳离子脂质体转染siRNA，使lnc-RLM的表达量降低,检测细胞中甘油三酯含量，发现实验组HepG2细胞中甘油三酯含量显著高于对照组（p=0.0005）。油酸刺激实验组HepG2细胞24h后，油红O染色，倒置显微镜下观察到实验组细胞脂滴数显著高于对照组，Huh7细胞中观察到相似现象（p=0.0005）。lnc-RLM的表达量降低的HepG2细胞中，ACC活性较对照组显著上调（p=0.0479）。Huh7细胞中也能观察到ACC活性较对照组显著上调（p=0.0069）。
4.HepG2细胞和Huh7细胞中分别利用阳离子脂质体转染siRNA方法，降低lnc-RLM表达量，检测脂质代谢相关调节因子，在两种细胞中均发现SREBP-1c、FAS、ACC、PPARγ的mRNA水平均较对照组升高（p值均小于0.05）；WesternBlot实验结果发现AMPK蛋白水平未发生显著变化，而磷酸化AMPK蛋白水平显著下调，其下游作用因子SREBP1c和FAS蛋白表达量则较显著上调。
5.敲低HepG2细胞和Huh7细胞中lnc-RLM表达量，分别用不同浓度A-769662刺激细胞24h。WesternBlot实验结果发现，AMPK总蛋白表达量未见显著变化，而其磷酸化水平相对于对照组依旧降低，A-769662对AMPK的激活作用受到影响。同时，SREBP1c蛋白表达量升高。
研究结论：
1.Lnc-RLM是一条与脂质代谢相关的未被报导的lncRNA；
2.HepG2细胞和Huh7细胞中抑制Lnc-RLM表达，可引起细胞中脂质沉积；
3.Lnc-RLM可以通过影响AMPK的磷酸化，进而影响HepG2细胞和Huh7细胞中脂质沉积。
为了深入研究长链非编码RNA与肝脏细胞脂质代谢之间的关系,通过lnc-RLM对肝脏细胞脂质沉积的影响，并对相关作用机制进行了初步探索。
研究方法：
1.Lnc-RLM的生物信息学特征
利用UCSC（http://genome.ucsc.edu/）数据库对lnc-RLM进行基因组定位以及物种间保守性分析；利用ORFFinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测lnc-RLM的潜在开放阅读框，并利用UCSC数据库比对开放阅读框编码可能性；运用CPAT（CodingPotentialAssessingTool）软件和CNCI软件分别分析lnc-RLM、lncRNAH19和GAPDH的编码能力；利用RNAfoldwebserver（http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）预测lnc-RLM二级结构。
2.Lnc-RLM的全长以及细胞定位
运用RLM-RACE和PCR对lnc-RLM进行全长扩增，通过胶回收、TA克隆、菌液PCR等实验挑选出含有目的序列的单克隆菌落，样本送上海桑尼生物科技有限公司测序，利用UCSC数据库进行序列比对。制备HepG2细胞细胞爬片，利用荧光原位杂交试剂盒（RiboTMFlourescentInSituHybridization）进行HepG2细胞中lnc-RLM原位杂交，激光共聚焦显微镜下观察HepG2细胞中lnc-RLM定位。
3.利用阳离子脂质体转染siRNA，分别降低HepG2细胞和Huh7细胞中lnc-RLM表达量，进行以下实验（HepG2细胞和Huh7细胞中实验方法相同，均以HepG2细胞为例）：
（1）分别检测HepG2细胞和Huh7细胞中甘油三酯含量
根据甘油三酯可在一系列酶的作用下，与对氯酚反应生成红色醌化物的原理，利用南京建成生物工程研究所甘油三酯（TG）测定试剂盒，检测细胞中甘油三酯含量。
（2）油酸刺激细胞24h后检测细胞中总甘油三酯含量
HepG2细胞加入400μM油酸刺激细胞24h,收集细胞，利用南京建成生物工程研究所甘油三酯（TG）测定试剂盒，检测细胞中甘油三酯含量。Huh7细胞中油酸浓度为500μM。
（3）油红O染色检测HepG2细胞和Huh7细胞中脂质分布
根据脂溶性染料油红O可在脂肪内能高度溶解，并能够特异使组织内甘油三酯着色的原理，在细胞处理完成后，利用倒置显微镜下观察细胞中脂质分布情况。
（4）HepG2细胞和Huh7细胞中检测乙酰辅酶A羧化酶（ACC）活性
细胞处理后，根据ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3、ATP生成丙二酰辅酶A、ADP和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量反应ACC活性的这一原理，检测细胞中ACC活性。
4.利用用qPCR及WesternBlot检测相关基因与蛋白的表达量。
利用阳离子脂质体转染siRNA，降低HepG2细胞中lnc-RLM表达量，收集细胞，提取RNA，利用Takara逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，根据南京诺唯赞生物科技有限公司PlatinumSYBRGreenqPCRSuperMix-uDGwithROX使用说明书，配制荧光定量PCR反应体系，设置相应反应条件，利用BioradCFX96Real-TimePCRSystem进行PCR扩增。检测脂质代谢相关基因（AMPK、SREBP-1c、FAS、ACC、PPARγ、HMGCR、PGC-1α）mRNA表达量。细胞处理后，通过WesternBlot实验检测脂质代谢相关基因（AMPK、SREBP-1c、FAS）蛋白水平表达量
5.A-769662刺激细胞24h，WesternBlot检测相关基因蛋白水平的表达量。
敲低HepG2细胞和Huh7细胞中lnc-RLM表达量，分别用不同浓度AMPK激动剂（A-769662）刺激细胞24h，收集细胞，提取总蛋白，WB实验检测脂质代谢相关基因蛋白质水平表达量。
研究结果：
1.Lnc-RLM位于人类12号染色体长臂23.1区域，含有一个外显子，拥有众多茎环结构，二级结构复杂，无蛋白质编码潜能。
2.Lnc-RLM全长1750nt，定位于细胞质内。
3.干扰lnc-RLM可以促进HepG2细胞和Huh7细胞中的脂质沉积。
利用阳离子脂质体转染siRNA，使lnc-RLM的表达量降低,检测细胞中甘油三酯含量，发现实验组HepG2细胞中甘油三酯含量显著高于对照组（p=0.0005）。油酸刺激实验组HepG2细胞24h后，油红O染色，倒置显微镜下观察到实验组细胞脂滴数显著高于对照组，Huh7细胞中观察到相似现象（p=0.0005）。lnc-RLM的表达量降低的HepG2细胞中，ACC活性较对照组显著上调（p=0.0479）。Huh7细胞中也能观察到ACC活性较对照组显著上调（p=0.0069）。
4.HepG2细胞和Huh7细胞中分别利用阳离子脂质体转染siRNA方法，降低lnc-RLM表达量，检测脂质代谢相关调节因子，在两种细胞中均发现SREBP-1c、FAS、ACC、PPARγ的mRNA水平均较对照组升高（p值均小于0.05）；WesternBlot实验结果发现AMPK蛋白水平未发生显著变化，而磷酸化AMPK蛋白水平显著下调，其下游作用因子SREBP1c和FAS蛋白表达量则较显著上调。
5.敲低HepG2细胞和Huh7细胞中lnc-RLM表达量，分别用不同浓度A-769662刺激细胞24h。WesternBlot实验结果发现，AMPK总蛋白表达量未见显著变化，而其磷酸化水平相对于对照组依旧降低，A-769662对AMPK的激活作用受到影响。同时，SREBP1c蛋白表达量升高。
研究结论：
1.Lnc-RLM是一条与脂质代谢相关的未被报导的lncRNA；
2.HepG2细胞和Huh7细胞中抑制Lnc-RLM表达，可引起细胞中脂质沉积；
3.Lnc-RLM可以通过影响AMPK的磷酸化，进而影响HepG2细胞和Huh7细胞中脂质沉积。