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研究背景和目的：
多溴二苯醚是一类溴化阻燃剂，用于许多领域的阻燃材料，包括电子、家具和建筑材料。由于其在化学上不与其他聚合物结合，因此多溴二苯醚具有很强的抗降解能力，能在人体和动物组织中生物蓄积。它们是潜在的环境污染物，有神经发育毒性、致畸毒性、致癌毒性、甲状腺毒性、肝毒性和内分泌干扰毒性。多溴二苯醚已于2009年被联合国环境规划署正式列入持久性有机污染物清单。4-溴二苯醚（BDE-3）是多溴二苯醚中最丰富、最基本的光降解产物。一些研究表明，BDE-3有降低精子活力和抑制精子发生等生殖毒性。然而，BDE-3是否会影响睾丸间质（Leydig）细胞的发育尚不清楚。Leydig细胞的主要功能是合成雄激素睾酮，其发育主要分为四个阶段：睾丸间质干细胞、祖细胞、幼细胞和成熟细胞。其中幼Leydig细胞在大鼠出生后第28天开始出现，该阶段的Leydig细胞表达睾酮合成酶与代谢酶。本研究的目的是探讨BDE-3对大鼠Leydig细胞青春期发育的影响。
研究方法：
1．BDE-3体外实验：取35日龄雄性SD大鼠18只，处死，取睾丸，用Percoll梯度离心法纯化幼Leydig细胞，在Leydig细胞培养基中培养，用0、0.05、0.5、5和50μM的BDE-3处理24小时。回收培养基，采用化学发光法测定培养基5α-雄二醇（DIOL）水平；收集幼Leydig细胞，用RT-qPCR测定幼Leydig细胞的Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd3b1、Hsd11b1、Nr5a1、Hsd17b3、Insl3、Srd5a1、Akr1c14的mRNA水平；用流式分析法测量幼Leydig细胞的凋亡率及ROS水平。
2．BDE-3体内实验：取24只28日龄雄性SD大鼠，随机分成4组：0mg/kg/天（玉米油对照组）、50mg/kg/天（低剂量BDE-3组）、100mg/kg/天（中剂量BDE-3组）和200mg/kg/天（高剂量BDE-3组），每组6只。从35日龄开始连续21天灌胃给予BDE-3（0、50、100和200mg/kg/天），记录动物体重变化。于56日龄时，处死动物，收集血清，采用化学发光法测量血清睾酮，ELISA法测量血清促黄体生成素（LH）和卵泡刺激激素（FSH）水平。取睾丸，称重，快速冰冻一侧睾丸，取部分组织提取RNA，经RT-qPCR法检测幼Leydig细胞Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd3b1、Hsd11b1、Nr5a1、Hsd17b3、Insl3和支持细胞的Fshr、Dhh、Sox9的mRNA水平；另取部分组织提取蛋白，经Westernblot检测幼Leydig细胞蛋白LHCGR、SCARB1、STAR、CYP11A1、HSD3B1、HSD17B3和支持细胞蛋白FSHR、DHH、SOX9以及信号通路蛋白AKT1、p-AKT1、AKT2、p-AKT2、ERK1/2、p-ERk1/2、AMPK和p-AMPK的水平；用Bouin’s液固定另一侧睾丸，脱水，包埋，石蜡切片，用免疫组织化学法染色HSD11B1（后期Leydig细胞特异性生物标记物）和CYP11A1（各期Leydig细胞的生物标记物）及SOX9（支持细胞的生物标记物），测定Leydig细胞以及支持细胞的数量、大小、核质大小及其蛋白表达水平。
研究结果：
1．体外实验表明，与对照组比较，?5μM浓度的BDE-3显著降低DIOL水平。RT-qPCR结果显示，50μM浓度的BDE-3显著下调Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd17b3和Srd5a1的表达，?0.05μM浓度的BDE-3显著下调Hsd3b1的表达，?0.5μM浓度的BDE-3显著下调Akr1c14的表达。流式细胞分析发现，?5μM浓度的BDE-3明显刺激幼Leydig细胞产生ROS，但其不造成幼Leydig细胞凋亡。
2．体内实验表明，BDE-3不影响大鼠体重及睾丸重量。与对照组相比，200mg/kg的BDE-3明显降低血清睾酮水平（P＜0.05），但不影响血清LH和FSH水平（P＞0.05）。200mg/kg的BDE-3降低了Leydig细胞大小及细胞质大小。RT-qPCR结果显示，?100mg/kg的BDE-3显著下调Lhcgr、Star、Dhh和Sox9的表达，而200mg/kg的BDE-3显著下调Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Hsd17b3、Fshr、Dhh和Sox9的表达。Westernblot结果显示，BDE-3（200mg/kg）显著降低LHCGR、SCARB1、STAR、CYP11A1、HSD3B1、HSD17B3、FSHR、DHH和SOX9蛋白的水平，100mg/kg的BDE-3显著降低LHCGR、DHH和SOX9蛋白水平。半定量免疫组织化学分析亦验证CYP11A1（200mg/kg的BDE-3组）以及SOX9（100和200mg/kg的BDE-3组）密度明显下降。同时，Westernblot结果也显示，BDE-3不影响AKT、ERK1/2和AMPK总蛋白的表达（P＞0.05），但明显降低p-AKT1、p-ERK1/2和p-AMPK的表达（P＜0.05）而造成p-AKT/AKT、p-ERK1/2/ERK1/2及p-AMPK/AMPK比值也较对照组明显下降（P＜0.05）。
研究结论：
青春期雄性大鼠暴露于BDE-3导致睾酮合成减少而引起青春期延迟。BDE-3可能间接通过干扰睾丸支持细胞分泌重要因子介导和直接抑制ERK1/2、AKT和AMPK的磷酸化以及诱导ROS产生而影响Leydig细胞青春期发育。
多溴二苯醚是一类溴化阻燃剂，用于许多领域的阻燃材料，包括电子、家具和建筑材料。由于其在化学上不与其他聚合物结合，因此多溴二苯醚具有很强的抗降解能力，能在人体和动物组织中生物蓄积。它们是潜在的环境污染物，有神经发育毒性、致畸毒性、致癌毒性、甲状腺毒性、肝毒性和内分泌干扰毒性。多溴二苯醚已于2009年被联合国环境规划署正式列入持久性有机污染物清单。4-溴二苯醚（BDE-3）是多溴二苯醚中最丰富、最基本的光降解产物。一些研究表明，BDE-3有降低精子活力和抑制精子发生等生殖毒性。然而，BDE-3是否会影响睾丸间质（Leydig）细胞的发育尚不清楚。Leydig细胞的主要功能是合成雄激素睾酮，其发育主要分为四个阶段：睾丸间质干细胞、祖细胞、幼细胞和成熟细胞。其中幼Leydig细胞在大鼠出生后第28天开始出现，该阶段的Leydig细胞表达睾酮合成酶与代谢酶。本研究的目的是探讨BDE-3对大鼠Leydig细胞青春期发育的影响。
研究方法：
1．BDE-3体外实验：取35日龄雄性SD大鼠18只，处死，取睾丸，用Percoll梯度离心法纯化幼Leydig细胞，在Leydig细胞培养基中培养，用0、0.05、0.5、5和50μM的BDE-3处理24小时。回收培养基，采用化学发光法测定培养基5α-雄二醇（DIOL）水平；收集幼Leydig细胞，用RT-qPCR测定幼Leydig细胞的Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd3b1、Hsd11b1、Nr5a1、Hsd17b3、Insl3、Srd5a1、Akr1c14的mRNA水平；用流式分析法测量幼Leydig细胞的凋亡率及ROS水平。
2．BDE-3体内实验：取24只28日龄雄性SD大鼠，随机分成4组：0mg/kg/天（玉米油对照组）、50mg/kg/天（低剂量BDE-3组）、100mg/kg/天（中剂量BDE-3组）和200mg/kg/天（高剂量BDE-3组），每组6只。从35日龄开始连续21天灌胃给予BDE-3（0、50、100和200mg/kg/天），记录动物体重变化。于56日龄时，处死动物，收集血清，采用化学发光法测量血清睾酮，ELISA法测量血清促黄体生成素（LH）和卵泡刺激激素（FSH）水平。取睾丸，称重，快速冰冻一侧睾丸，取部分组织提取RNA，经RT-qPCR法检测幼Leydig细胞Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd3b1、Hsd11b1、Nr5a1、Hsd17b3、Insl3和支持细胞的Fshr、Dhh、Sox9的mRNA水平；另取部分组织提取蛋白，经Westernblot检测幼Leydig细胞蛋白LHCGR、SCARB1、STAR、CYP11A1、HSD3B1、HSD17B3和支持细胞蛋白FSHR、DHH、SOX9以及信号通路蛋白AKT1、p-AKT1、AKT2、p-AKT2、ERK1/2、p-ERk1/2、AMPK和p-AMPK的水平；用Bouin’s液固定另一侧睾丸，脱水，包埋，石蜡切片，用免疫组织化学法染色HSD11B1（后期Leydig细胞特异性生物标记物）和CYP11A1（各期Leydig细胞的生物标记物）及SOX9（支持细胞的生物标记物），测定Leydig细胞以及支持细胞的数量、大小、核质大小及其蛋白表达水平。
研究结果：
1．体外实验表明，与对照组比较，?5μM浓度的BDE-3显著降低DIOL水平。RT-qPCR结果显示，50μM浓度的BDE-3显著下调Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd17b3和Srd5a1的表达，?0.05μM浓度的BDE-3显著下调Hsd3b1的表达，?0.5μM浓度的BDE-3显著下调Akr1c14的表达。流式细胞分析发现，?5μM浓度的BDE-3明显刺激幼Leydig细胞产生ROS，但其不造成幼Leydig细胞凋亡。
2．体内实验表明，BDE-3不影响大鼠体重及睾丸重量。与对照组相比，200mg/kg的BDE-3明显降低血清睾酮水平（P＜0.05），但不影响血清LH和FSH水平（P＞0.05）。200mg/kg的BDE-3降低了Leydig细胞大小及细胞质大小。RT-qPCR结果显示，?100mg/kg的BDE-3显著下调Lhcgr、Star、Dhh和Sox9的表达，而200mg/kg的BDE-3显著下调Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Hsd17b3、Fshr、Dhh和Sox9的表达。Westernblot结果显示，BDE-3（200mg/kg）显著降低LHCGR、SCARB1、STAR、CYP11A1、HSD3B1、HSD17B3、FSHR、DHH和SOX9蛋白的水平，100mg/kg的BDE-3显著降低LHCGR、DHH和SOX9蛋白水平。半定量免疫组织化学分析亦验证CYP11A1（200mg/kg的BDE-3组）以及SOX9（100和200mg/kg的BDE-3组）密度明显下降。同时，Westernblot结果也显示，BDE-3不影响AKT、ERK1/2和AMPK总蛋白的表达（P＞0.05），但明显降低p-AKT1、p-ERK1/2和p-AMPK的表达（P＜0.05）而造成p-AKT/AKT、p-ERK1/2/ERK1/2及p-AMPK/AMPK比值也较对照组明显下降（P＜0.05）。
研究结论：
青春期雄性大鼠暴露于BDE-3导致睾酮合成减少而引起青春期延迟。BDE-3可能间接通过干扰睾丸支持细胞分泌重要因子介导和直接抑制ERK1/2、AKT和AMPK的磷酸化以及诱导ROS产生而影响Leydig细胞青春期发育。