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肺炎克雷伯菌是重要的社区和医院获得性革兰阴性机会致病菌，可以导致患者发生血流感染、肺炎、肝脓肿及尿路感染等，耐药及毒力因素是其重要的致病机制。耐药方面，碳青霉烯类抗生素是治疗产ESBL超广谱β内酰胺酶的最后防线，但是近年来随着其在重症感染中的广泛应用，碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌在全球范围内广泛播散，成为抗感染治疗的重大威胁。毒力方面，目前有关肺炎克雷伯菌尤其是高致病力肺炎克雷伯菌(hvKP)的毒力机制的研究尚缺乏。研究表明:铁载体、高黏液表型、表面多糖、荚膜多糖、脂多糖及生物被膜的形成等机制可能是hvKP毒力增高的重要原因。本课题通过收集我院临床分离的碳青霉烯中介或耐药的肺炎克雷伯菌和高致病力肺炎克雷伯菌，掌握其流行分布状况，通过对耐药方面的研究，明确碳青霉烯酶的检出状况、克隆分布、探索常见耐药基因的遗传特征和传播特点，并从分子水平探讨耐药基因的起源、发展及扩散机制;毒力方面，明确hvKP菌株重要的毒力基因特点及分子分型，探讨hvKP菌株毒力增高的可能机制;此外，通过分析重症监护病房内肺炎克雷伯菌等重要耐药致病菌临床感染特点，评估降阶梯防控耐药菌交叉感染的防控措施实施效果。通过上述研究明确本地区肺炎克雷伯菌的流行病学特点、克隆分布、临床感染状况，为临床肺炎克雷伯菌的防治提供新的依据。 一、肺炎克雷伯菌产碳青霉烯酶的主要类型及基因结构分析 目的:明确本院肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶的检出状况、克隆分布、常见耐药基因的遗传特征和传播特点。方法:收集本院对亚胺培南或美罗培南K-B法抑菌环≤22mm的肺炎克雷伯菌株，采用PCR方法扩增常见的碳青霉烯酶基因;采用多位点序列分析及脉冲场凝胶电泳方法对肺炎克雷伯菌进行分型;通过质粒接合试验明确携带耐药基因的质粒的可转移性，采用S1酶切脉冲场凝胶电泳、质粒电泳及酶切进行质粒同源性分析;通过PCR方法扩增耐药基因周围基因环境，并对相关质粒进行测序。结果:本研究中共收集碳青霉烯耐药及中介肺炎克雷伯菌株76株，其中76.31％(58/76)的菌株中检出碳青霉烯酶，48株携带blaKPC-2基因，6株携带blaIMP-4基因，1株携带blaIMP-8基因，其中1株细菌同时携带blaKPC-2与blaIMP-4基因，2株细菌携带blaNDM-1基因，未检出携带blaOxA-48、blaVIM基因;48株携带blaKPC-2基因的肺炎克雷伯菌的MLST结果显示:43例菌株的MLST分型为ST11，3例为ST15，其余两例分别为ST43和ST617，另外2例blaNDM-1肺炎克雷伯菌的MLST分型均属于ST11型;48株携带blaKPC-2基因的肺炎克雷伯菌PFGE分型分为(A～L)12种不同的分型，其中16株A1型肺炎克雷伯菌在外科重症监护病房、急诊重症监护病房及呼吸重症监护病房内暴发流行，2例blaNDM-1肺炎克雷伯菌株的PFGE显示属于同一克隆的同一亚型;质粒接合试验中4例携带blaKPC-2基因的质粒接合成功，2例携带blaNDM-1基因的质粒接合成功;S1-PFGE实验及Southern杂交试验显示不同克隆菌株的blaKPC-2基因位于不同大小的质粒上，2例blaNDM-1基因位于大约110Kb的质粒上;对于碳青霉烯酶周围基因环境分析发现blaKPC-2基因主要为ISKpn8-blaKPC-2-ISKpn6 like结构，blaNDM-1基因周围结构为ISCR3-rmtC-ISAba125-blaNDM-1-bleMBL-DsbC-cutA1-GroES-GroEL-insE-ISEhe3。 结论:我院分离的肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶的基因型以blaKPC-2为主，MLST分型主要为ST11型，并首次在上海地区检出2例NDM-1阳性菌株，耐药基因容易通过患者间及医疗相关操作造成交叉感染，临床工作中应积极监测并采取有效的防控措施。 二、高致病力肺炎克雷伯菌的毒力基因特点和分子流行病学分析 目的:明确本院高致病力肺炎克雷伯菌检出状况，毒力基因特点、传播方式及临床特点。方法:对于本院2014年9月至2015年1月临床标本中分离的肺炎克雷伯菌，采用纸片扩散法（K-B法）对药敏进行初步评估，string test实验对其黏液表型进行评估;并采用PCR法扩增常见的毒力基因K1、K2、RmpA、RmpA2、allS、mrkD、kfuBC、cf29a、fimH、uge、wabG、ureA等基因;采用多位点序列分析及脉冲场凝胶电泳方法对肺炎克雷伯菌株进行分型。结果:自2014年9月至2015年1月期间，我院临床标本中共分离到肺炎克雷伯菌455株，共分离到高致病力肺炎克雷伯菌54例，检出率达到11.86％。标本主要分离自痰液、肝脓肿穿刺液、胆汁分泌物等胃肠道分泌物中，其中3例菌株对碳青霉烯类抗生素中介。对26株hvKP菌株的毒力基因检测结果显示:K1荚膜抗原基因的检出率为8/26(30.77％)，K2荚膜抗原的检出率为11/26(42.30％)，黏液表达基因RmpA2的检出率为24/26(92.31％)，allS基因的检出率为7/26(26.92％)，kfuBC基因的检出率14/26(53.85％)，cf29a基因的检出率8/26(30.77％)，RmpA、mrkD、fimH、uge、wabG、ureA基因的检出率均为100％。对26株高致病力肺炎克雷伯菌的MLST检测中共检出ST23型5例、ST86型4例、ST374型5例、ST375型2例、ST412型5例、ST680型1例、ST11型1例、ST692型1例、2例菌株MLST分型未定义;PFGE分型显示高致病力肺炎克雷伯菌条带呈多样性，与目前台湾测序的NTUH-K2044菌株结构不同。结论:hvKP菌株在肺炎克雷伯菌的检出率逐年增高，其MLST分型和PFGE分型呈多样性，其高致病力临床特点及耐药性不断增加的现状值得临床关注。 三、重症监护病房内多重耐药菌的临床防控 目的:重症监护病房内的耐药菌容易通过患者及医疗相关活动造成交叉感染及克隆传播，本研究通过实施降阶梯分级防控策略来有效降低耐药菌的交叉感染，以期减少耐药菌定植与感染，改善患者预后。方法:本研究采用前后对比、干预对照研究方法，对2013年8月至2014年7月期间外科监护病房(SICU)连续收治的危重患者进行主动性、多部位耐药菌筛查。其中在2014年2月至2014年7月期间在SICU实施组合式降阶梯防控策略。结果:本研究期间SICU共入住患者184例，对照组和干预组各92例。对照组检出多重耐药菌69例，干预组41例;两组患者多重耐药菌株检出率分别为75％和44.57％，p＜0.001;其中两组患者ICU内获得性多重耐药菌株分别为55和26株，ICU内多重耐药菌株检出率分别为59.78％和28.26％，p＜0.001;对照组和干预组的ICU获得性多重耐药菌感染千日率分别为14.12‰和7.64‰，p=0.16; ICU获得性多重耐药菌血流感染千日率分别为3.14‰和0.69‰，p=0.45; ICU获得性多重耐药菌肺炎感染千日率分别为6.28‰和1.39‰，p=0.16; ICU获得性多重耐药菌腹腔感染千日率分别为4.18‰和2.78‰，p=0.88;干预组患者多重耐药菌感染归因死亡率低于对照组(5.43‰VS13.04‰，p=0.07)。结论实施降阶梯防控措施能有效减少ICU患者获得性多重耐药菌定植与感染，降低ICU患者多重耐药菌感染归因死亡率。