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一、研究背景和目的：
鼻咽癌(NPC)是我国南方常见的恶性肿瘤之一，广东省的鼻咽癌发病率居世界首位。鼻咽癌的发病与遗传、Epstein-Barr病毒(EB病毒)、饮食、环境等多因素相关，是一种多因素、多步骤的复杂性疾病。一般认为遗传因素、EB病毒、环境因素协同作用，互相促进，最终导致机体细胞发生遗传学上的改变，产生可传代的鼻咽癌细胞的恶性表型。可以认为鼻咽癌的高癌家系遵循孟德尔单基因遗传传递模式，而鼻咽癌的发生大部分为散发病例(90％以上)，高癌家族仅代表了少量具有高度外显率的低频的遗传易感基因的作用结果，而绝大多数鼻咽癌的发病是遵循多基因一环境交互作用的模式，这些基因往往具有低外显率、人群高频率的特点。基因多态性导致基因功能的改变，使个体对环境致癌因素的反应发生相应改变，从而导致患癌危险的差异，即易患性的差异。推测鼻咽癌地区和种族差异的重要原因之一就是这些环境应答基因的某些多态性在地区或人群分别差异造成的。与肿瘤相关的环境应答基因包括：生物代谢与解毒基因、DNA修复基因、受体基因、细胞周期基因、细胞死亡控制基因等。 EB病毒作为一种特殊的环境致病因子，与鼻咽癌高度相关：鼻咽癌患者血清中EB病毒特异性抗体VCA-IgA、EA-IgA及DNA酶抗体水平显著升高；EB病毒的感染发生于鼻咽癌细胞单克隆增殖之前；EB病毒DNA及其表达产物在鼻咽癌病灶中的广泛检出等，均提示EB病毒在鼻咽癌的发生发展中起着重要作用。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)在天然免疫中可发挥重要的抗感染免疫功能，并与免疫耐受、特异性抗感染免疫以及一些疾病具有相关性。TLRs家族能识别包括各种细菌细胞壁成分、鞭毛蛋白、细菌DNA和病毒的双链RNA等在内的病原相关分子模式(PAMPs)，使宿主免疫系统识别入侵病原体并经常把它们清除出去。TLRs受体的活化能导致转录因子NF-κ B等的激活，诱导促炎细胞因子和与免疫相关的细胞因子的分泌。TLR家族共有10个成员，其中TLR8、TLR7、TLR9和TLR3这四个基因定位于细胞内相同的位置——内含体(endosome)，能有效诱导I型干扰素的表达，在抗病毒感染中发挥重要作用。TLR3和TLR9分别识别双链DNA和CpG-DNA，TLR7和TLR8识别来自病毒的单链RNA。
与鼻咽癌关系密切的EB病毒是双链DNA，在鼻咽癌的发生和发展中起着重要作用。TLR3，7，8，9这四个与病毒感染高度相关的受体与EB病毒的感染是否存在一定的关系从而影响鼻咽癌的发病呢?本研究希望能在基因多态性方面揭示这四个受体与鼻咽癌的相关性。
二、研究方法采用病例一对照的研究方法。
具体分两步进行：首先以小样本为研究对象，选取24例鼻咽癌散发病例，针对NCBIGenebank中TLR3，7，8，9四个基因的全部外显子，部分内含子以及第一个外显子上游2kb的区域设计引物进行PCR扩增，产物在于ABI377测序仪上测序，序列读解采用Chromas软件，目的在于寻找和验证SNP位点，并筛选出合适频率的SNPs用于下一步实验。以约500例的广东鼻咽癌散发病例及约500例广东正常人为研究对象，针对已筛选出的SNPs进行批量PCR扩增。基因分型采用直接测序法或限制性内切酶酶切法，测序结果采用Phred/Phrap/consed软件包、DNAStar/Seqman或Chromas软件读解，酶切法的结果采用2％琼脂糖凝胶电泳分型。基因分型的数据由SPSS11.0统计软件按病例一对照模式进行分析。等位基因及基因型与鼻咽癌的关系主要通过计算0Rs，95％CI和P值来分析，P值小于0.05视为有统计学差异。
三、结果
3.1.在分析了24个散发NPC病人样本后，一共筛选出11个SNPs用于下一步的病例一对照研究，包括：TLR3基因中的四个(A829C，C9948T，C13766T，C13909T)，TLR7中1个(T373C)，TLR8中1个(C-69G，A77G，Cl6654G，Al7002C)，TLR9中2个(T-852C，G3483A)。
3.2.TLR3 A829C等位基因使鼻咽癌的患病风险增加了42％(P=0.012)，当按照年龄≤30岁，≤35岁，≤40岁和≤45岁分层后，可以看到这种危险性在低年龄组更明显，OR值分别为1.70，1.48，1.43和1.39。
3.3.按EB病毒的VCA-IgA抗体滴度分层(≤1：20)后，TLR3的C9948T和C13909T显示出它们与鼻咽癌的相关性。C9948T表现为危险因素，OR值为1.81(95％CI，1.08-3.02)，并且纯合子TT较杂合子TC的患病风险更高，前者OR值为2.23，而后者则为2.16。相反的，13909T则对患鼻咽癌表现为保护作用，OR值为0.63(95％CI，0.38-1.04)，该位点能引起第412位的氨基酸改变(Leu>Phe)。
3.4.TLR8 5’UTR的G77A在年龄分层后显示出对鼻咽癌的发病有保护作用，并且年龄越低，这种保护作用越明显。在≤35岁，≤40岁和≤45岁三个年龄组中OR值分别为0.62(0.43-0.91)，0.70(0.51-0.96)，0.78(0.58-1.03)。G77A的位置特殊，刚好位于1型异构体的起始密码子，从而导致GTG>ATG的变化，引起TLR8蛋白在两种不同异构体之间的转换。
3.5 TLR3的C13766T位点，TLR7的T373C位点，TLR8的C-69G，C16654G和Al7002C位点，TLR9的T-852C和G3483A位点在病例组和对照组之间的频率分布无差异，即使在年龄或EB抗体滴度分层后也未显示出差异，提示这些变异位点与鼻咽癌的发病不相关。
四.结论
1.TLR3基因A829C位点的变异增加了鼻咽癌的患病风险，这种风险在低年龄人群中更明显。
2.TLR3基因的C9948T和C13909T在VCA-IgA抗体滴度≤1：20的病例组和对照组中的分布有明显差异，前者对鼻咽癌是危险因素，后者是保护因素。
3.TLR8基因的G77A位点在不同年龄组中显示出保护作用，在低年龄组中保护作用更明显。