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呼肠孤病毒科成员，如哺乳动物呼肠孤病毒(Mammalian orthoreovirus，MRV)和禽呼肠孤病毒(Avian orthoreovirus，ARV)，能在感染细胞中形成一种特化结构，称之为病毒包涵体(Viral inclusion bodies，VIBs)或病毒加工厂(Viral factory，VF)。研究发现，草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)在感染的细胞中同样形成病毒包涵体结构，并已证实非结构蛋白NS80为诱导包涵体结构形成的主要成分。作为水生呼肠孤病毒属代表株，GCRV被公认为其属中致病性最强的毒株之一。因此，以GCRV为模型，研究非结构蛋白NS80在病毒复制过程中的功能，将为进一步揭示水生呼肠孤病毒致病机制奠定基础。本论文共分为四章: 第一章:引言。本章在简要介绍呼肠孤病毒的理化性质、形态结构与分类等基本特征的基础上;重点概述了草鱼呼肠孤病毒结构蛋白和非结构蛋白的功能;结合MRV包涵体形成相关重要蛋白μNS及其同源蛋白在病毒组装与复制过程中的功能等相关研究进展，提出了本论文的研究目的和意义。 第二章:GCRVVP1，VP3，VP4内衣壳蛋白的抗体制备。GCRVVP1，VP3，VP4蛋白是病毒内衣壳组分，推测其可能参与了病毒的复制。为研究VP1，VP3，VP4蛋白在病毒复制过程中的作用，本论文首先构建了原核表达重组质粒pRA/VP1，pRA/VP3， pRC/VP4，并获得了高效表达的重组目的蛋白。将纯化的重组蛋白免疫小鼠，制备得到VP1，VP3，VP4蛋白的特异性抗体。其结果为研究VP1，VP3，VP4蛋白在病毒复制与组装中的相关功能奠定了基础。 第三章:GCRV非结构蛋白NS80在病毒复制中的功能研究。本研究利用已制备的GCRV相关蛋白特异性抗体，进行了NS80与结构蛋白(VP1-VP7)的亚细胞定位研究。在转染细胞中进行的免疫荧光实验发现，单独表达的病毒结构蛋白均不能形成病毒包涵体结构。在与NS80共同转染细胞中，NS80能改变内衣壳蛋白(VP1-VP4和VP6)的表型并将其招募到包涵体结构中。免疫共沉淀实验表明，在共同转染的细胞中，NS80分别与5个内衣壳蛋白存在相互作用。同时，GCRV感染细胞的免疫荧光和免疫共沉淀实验证实，内衣壳蛋白定位于NS80形成的包涵体结构中并与NS80存在相互作用，而外衣壳蛋白（VP5和VP7）与NS80无共定位与互作关系。以上结果提示，在GCRV感染过程中，NS80通过与内衣壳蛋白的相互作用将其滞留在包涵体结构中。 为解析病毒RNA合成位点，通过BrU标记病毒新合成的RNA，并结合相应抗体的免疫荧光实验发现，GCRV新生正义链RNA定位于NS80形成的包涵体结构中。对病毒结构蛋白的Western blot分析和qRT-PCR时相监测结果表明，NS80在病毒感染6h时可以被检测到。病毒主要内衣壳蛋白VP3和塔状结构蛋白VP1在病毒感染9h时可以被检测到，而VP3的表达量明显高于VP1蛋白。同时，我们还发现，病毒的滴度随着各结构蛋白表达量的增加明显提高，在感染18h时达到峰值。此外，RNA干扰实验显示，NS80的敲减(knockdown)不仅降低了内衣壳蛋白和外衣壳蛋白的表达水平，同时显著影响了GCRV子代病毒粒子的产生。以上结果表明，NS80蛋白在病毒的复制过程中起着重要作用。 第四章:GCRV VP2蛋白体外聚合酶活性研究。序列分析表明，GCRV VP2蛋白与MRV聚合酶λ3蛋白具有高达41％的同源性，是两个病毒中同源性最高的蛋白。本研究首次采用杆状病毒表达系统，构建了His-VP2融合蛋白，免疫荧光和Western blot结果表明，VP2融合蛋白在Sf9细胞中成功获得表达。进一步的体外聚合酶特性分析显示，纯化的VP2重组蛋白具有poly(C)依赖的poly(G)聚合酶活性。在28℃及10mmol/L Mg2+浓度条件下，该酶呈现最佳活性。本研究结果为进一步揭示VP2蛋白及其酶活位点在病毒转录与复制中的功能提供了实验依据。