红发夫酵母虾青素的分离纯化及虾青素免疫机理的研究

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虾青素是一种具有极强抗氧化和抗衰老活性的类胡萝卜素,被誉为“超级维生素E”,在医药、保健和化妆品等方面有着广泛的应用价值。为了满足日益增加的市场需求,急需进一步降低虾青素的生产成本,目前市售虾青素主要来源是雨生红球藻,而对于红发夫酵母来源虾青素的分离提纯却鲜有报道;另一方面,虽然虾青素强大的生理功能已逐渐被人所知,但对其免疫功能及其作用机理尚未有深入的研究报道,为使虾青素在人类健康方面更好地发挥作用,对其免疫机理的研究也是非常必要的。  本文首先对红发夫酵母虾青素的分离纯化进行研究。采用高压匀浆破碎法破碎红发夫酵母细胞,考察不同破碎压力、破碎次数和处理量对细胞破壁及虾青素萃取率的影响;结果表明,采用4 mL乙醇萃取0.03 g菌体,并在40 kpsi压力下破碎4次时,其虾青素萃取率最高可达71.93%。在此基础上,对虾青素的萃取相转移条件进行优化,结果表明采用5 mL乙醇萃取液与4mL正己烷、5 mL双蒸水混合时,虾青素的相转移率可达98.27%;最后,进一步对硅胶柱层析分离纯化萃取相中的虾青素进行了研究,结果表明最佳分离条件为使用20 g100-200目硅胶,装柱20 mL,以8 mL虾青素浓度为29.29 mg·L-1的正己烷相转移液进样,采用正己烷/丙酮=95/5(v/v)的洗脱剂洗脱前三个杂质条带后,再使用正己烷/丙酮=90/10(v/v)的洗脱剂洗脱虾青素条带,最终可以得到纯度大于95.5%的虾青素。  其次,本文以小鼠和大鼠为研究对象,考察虾青素对生物体免疫性能的影响。通过对小鼠灌胃低(4 mg·kg-1· d-1)、中(20 mg·kg-1·d-1)和高剂量(100 mg·kg-1·d-1)的虾青素,考察虾青素对实验组与对照组的免疫器官脏器指数、巨噬细胞吞噬功能和血清抗体水平。结果表明,各剂量组小鼠血清抗体水平均显著升高(P<0.01),中剂量组小鼠脾脏指数显著升高(P<0.05),中、高剂量组小鼠的胸腺指数和吞噬系数均显著升高(P<0.05)。采用腹腔注射D-半乳糖的方式建立大鼠的致衰老模型,考察虾青素灌胃对其免疫器官脏器指数及其形态的影响。结果显示,衰老灌胃虾青素组与衰老对照组相比胸腺指数显著升高(P<0.01),同时D-半乳糖诱导致使的肝脏、胸腺和脾脏细胞损伤得到明显改善。由此可以看出,虾青素可提高非特异性免疫和体液免疫功能,该结果为虾青素免疫机理的进一步研究奠定了基础。  最后,为探讨虾青素的免疫机理,本文对动物实验中四组大鼠的血清进行蛋白质组学分析。通过一维电泳考察了不同方法对血清高丰度蛋白的去除效果,结果表明使用Bio-rad血清白蛋白清除试剂盒处理血清样品的效果最佳;此外,通过LC-MS/MS分析,发现无论正常组大鼠还是致衰老模型组大鼠,在灌胃虾青素后,大鼠血清中αB晶状体蛋白、细胞外基质蛋白-1、Ras相关蛋白Rab-27B和激肽原蛋白-1等与肿瘤等恶性病相关蛋白表达下调,而补体第二激活途径中备解素蛋白P分子和补体C8蛋白分子的表达量上调;因此推测虾青素促进大鼠机体免疫功能的机制为:抑制恶性细胞增殖,激活免疫系统T细胞;且通过强化免疫系统的补体第二激活途径,在感染早期便发挥免疫作用。
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