【摘 要】
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目的：骨钙素(OCN)三个γ谷氨酸能够被γ谷氨酸羧化酶(GGCX)羧基化,在骨形成和发育以及组织器官间交互调控中起重要作用.CRISPR/Cas9是近来兴起的一项基因编辑新技术,通过突变靶点实现基因敲除.本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除GGCX基因,并评估CRISPR/Cas9基因编辑系统基因敲除效率及其应用前景.方法：针对GGCX外显子设计gRNA(gRNA1和gRNA2),分别
【机 构】
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中国航天员科研训练中心航天医学基础与应用国家重点实验室 北京100094
【出 处】
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中国空间科学学会空间生命专业委员会第二十届学术研讨会暨中国宇航学会航天医学工程与空间生物学专业委员会第四届学术研讨会
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目的：骨钙素(OCN)三个γ谷氨酸能够被γ谷氨酸羧化酶(GGCX)羧基化,在骨形成和发育以及组织器官间交互调控中起重要作用.CRISPR/Cas9是近来兴起的一项基因编辑新技术,通过突变靶点实现基因敲除.本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除GGCX基因,并评估CRISPR/Cas9基因编辑系统基因敲除效率及其应用前景.方法：针对GGCX外显子设计gRNA(gRNA1和gRNA2),分别与Cas9质粒共转染到前成骨细胞MC3T3-E1,通过测序检测基因编辑的有效性.随后,将gRNA与Cas9连入同一载体构建Cas9-gRNA1、 Cas9-gRNA2、Cas9-gRNA1-gRNA2三个基因敲除工具质粒.三个质粒分别转染到MC3T3-E1中,72小时提取基因组DNA,PCR扩增靶点片段,连入TA克隆载体,测序检测三种质粒基因敲除效率.将gRNA1、gRNA2、Cas9及Cas9-gRNA1-gRNA2质粒分别转染到MC3T3-E1和C2C12细胞72小时,RT-qPCR的方法检测成骨转录因子Runx2、成骨细胞标志基因骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)和Ⅰ型胶原α1链(Col1a1)表达变化情况.结果：(1)测序结果示特定GGCX靶点位置都出现套峰,两条设计的gRNA有效.(2) Cas9-gRNA1-gRNA2转染细胞后剪切效率为83.3％ (20/24),明显高于Cas9-gRNA1的65％(15/23)和Cas9-gRNA2的56％(14/24).(3)gRNA1、gRNA2、Cas9各自转染MC3T3-E1,RT-qPCR结果示Runx2、OCN、ALP和Col1a1变化无显著.(4) Cas9-gRNA1-gRNA2转染MC3T3-E1,RT-qPCR结果表明Runx2基因没有明显变化,而成骨细胞标志基因OCN、ALP、Col1a1显著下降；而转染C2C 12后,Runx2、OCN、ALP、Col1a1显著下降.结论：利用CRISPR/Cas9基因编辑系统成功实现了GGCX基因的敲除；设计多个gRNA靶点能够增加敲除效率.Cas9和gRNA不影响前成骨细胞MC3T3-E1的骨向分化能力,说明CRISPR/Cas9基因编辑系统对细胞没有毒性作用.可以用于下一步研究GGCX在骨骼发育中的作用.
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