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目的：构建表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)免疫优势抗原Ag85A的DNA疫苗,分析其加强免疫后提高卡介苗(BCG)初免小鼠的抗结核保护效力与T细胞免疫反应及其二者之间的相关性.
方法：以Mtb毒株H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增Ag85A抗原编码的结构基因并克隆至真核表达载体pVAX1中构建其DNA疫苗;接着,将纯化后的该DNA疫苗加强免疫BCG初免小鼠二针,以BCG和DNA单独免疫小鼠为对照,免疫8周后以低剂量Mtb标准菌株H37Rv攻击免疫小鼠,5周后分析感染小鼠肺/脾的荷菌载量及肺脏病理变化以评估其免疫保护效果;同时,在攻击当天分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,分别应用IFN-γ酶联免疫斑点实验(ELISPOT)和多因子胞内流式细胞术(intracellular staining)分析免疫小鼠的Mtb抗原特异性效应细胞免疫水平与分泌IFN-γ/TNF-α/IL-2的多功能CD4+T细胞频率及其强度并比较免疫保护效力及其T细胞免疫应答水平之间的相关性.
结果：与BCG免疫及DNA单独免疫组相比,Ag85A DNA加强免疫显著降低了感染小鼠脏器的细菌载量,且肺部CFU荷菌量下降与感染肺部的病变程度减轻及炎性细胞因子低水平表达相关;进一步分析这种BCG初免-DNA加强(B/D)免疫策略所诱导产生的免疫原性,结果发现B/D免疫策略所诱导增强的免疫保护效力与免疫接种后所诱导产生的脾脏IL-2分泌性CD4 T细胞频率或IL-2表达量的提高直接相关.
结论：本研究成功构建了表达Mtb免疫优势抗原Ag85A的DNA疫苗,证实了BCG初免-DNA加强的免疫策略可显著增强小鼠的T细胞免疫应答并提高其抗结核保护效力,相关性分析结果提示测定免疫接种后诱导的抗原特异性IL-2水平或者IL-2产生的CD4 T细胞频率可以预测新疫苗或免疫策略的抗结核保护效果(至少可预测B/D免疫策略),为抗结核新疫苗的免疫学评价提供了理论依据和实践基础,并为亚单位疫苗加强BCG初始免疫的保护效果提供了依据.