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目的：探讨孕期开始的体内维生素A(vitamin A,VA)水平对间充质干细胞(MSC)移植治疗缺氧缺血脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)损伤大鼠神经组织功能修复的影响.方法：将144只7d龄wistar大鼠随机分为VA正常移植细胞组(VA NM),VA缺乏移植细胞组(VADM)和HIBD对照组.通过不同VA摄入量控制模型鼠VA水平正常或缺乏,VADM和VANM两组给予HIBD损伤,HIBD损伤24h后每只大鼠腹腔移植1*106MSC.高效液相色谱法检测血清VA水平评估模型鼠体内VA营养水平.各组分别在修复中晚期测试神经功能损伤评分(mNSS),Morris水迷宫和穿梭箱评估神经认知功能.钙影像分析两组海马CA1区椎体神经元的NMDA诱导的钙内流现象.TTC染色评估VADM和VANM两组损伤后脑组织梗死面积.在修复的极期通过EdU新生细胞标记术评估两组损伤后细胞新生的能力,通过Tunnel染色评估两组极期细胞凋亡.流式细胞术分析缺氧缺糖损伤(OGD)的原代神经元在各浓度全反式视黄酸(ATRA)联合MSC处理下的细胞凋亡和线粒体膜电位变化.进一步分析各组海马组织和原代神经元RA信言号,TGF-β信号和线粒体凋亡通路分子的基因和蛋白水平差异.结果：(1)整个实验期VADM和VAN M两组模型鼠血清VA水平分别控制在0.4～0.8μmol/L、 0.7～1.3μmol/L,符合实验要求.(2)功能学结果：术后7,14,21和28d神经功能损伤评分VADM组显著高于VANM组,HIBD组评分显著高于其它两组.术后23d开始的Morris水迷宫测试VADM组的寻找平台平均潜伏时间和寻找平台距离在测试的2～5d显著长于VANM组,穿越平台次数显著低于VANM组,HIBD组的寻找平台平均潜伏时间和寻找平台距离在整个测试期均显著高于其它两组,穿越平台次数显著少于其它两组.术后28d开始的穿梭箱测试VADM组在测试期2-5d主动逃避率显著低于VANM组(n=20),在4-5d未逃避率显著高于VANM组,HIBD组主动逃避率显著低于其它两组,未逃避率显著高于其它两组.VADM组海马CA1区椎体细胞的50μmol/LNMDA激发的钙震荡效应在HIBD损伤的急性期(术后3-7d)明显强于VANM组,而在修复的晚期(术后14-30d)则显著弱于VANM组.以上内容提示体内VA正常可显著促进MSC移植治疗HIBD后的神经功能恢复.(3)组织学结果：术后7d大体形态可见VADM组的损伤侧(左侧半脑)梗死面积显著大于VANM组,但VADM和VANM梗死面积均显著小于HIBD组.MSC移植后2、7d我们评估了MSCs在脑内定植,在两组移植MSCs组仅在皮层区发现有MSC的定植(绿色荧光),而在海马区未发现有MSCs的定植,并且在颞叶和顶叶皮层,移植后的2d和7dVANM组MSC定植要显著多于VADM组.移植后2d、7d,VADM组海马CA1,CA3,DG和顶叶皮层,颞叶皮层的新生细胞(EdU阳性细胞,红色荧光)显著少于VANM组,且海马的新生细胞主要出现在椎体细胞层,皮层主要区域在layer2-5区,移植后2dEdU阳性细胞显著多于7d.MSC移植后2dVADM组海马CA1,CA3,DG和顶叶皮层,颞叶皮层的细胞凋亡明显重于VANM组(黄箭头所示绿色荧光),且两组的海马细胞凋亡主要存在于椎体细胞层和分子层区,皮层凋亡主要出现在layer3-5,在移植后7dVADM凋亡也显著重于VANM组,且凋亡的发生区较2d开始缩小,海马细胞凋亡集中于椎体层区,皮层的layer2-5都可见明显的细胞凋亡.以上内容提示体内VA缺乏可显著抑制MSC移植治疗HIBD后的神经组织修复.(4)基因蛋白结果：我们发现RARα的mRNA和蛋白水平在HIBD损伤的极期(术后3-7d) VADM组都显著高于VANM组,在修复中到晚期(术后14-28d) RARα的mRNA和蛋白水平VADM组则显著低于VANM组,RARα和RXRγ受体是各RA受体表达的优势受体.进一步发现VADM组的神经元标志物NSE的mRNA和蛋白水平在HIBD术后14d都显著低于VANM组,神经胶质细胞标志物GFAP的mRNA和蛋白水平在21-30d VADM组则显著低于VANM组,神经干细胞标志物Nestin的mRNA和蛋白水平在HIBD术后3,14dVADM组显著低于VANM组,在损伤后3、7、14dVADM组GDNF表达显著低于VANM组,而TGF-β1在损伤后3-7dVADM组显著高于VANM组,7-14dVADM组显著低于VANM组.于是我们检测了HIBD的极期和中期细胞凋亡的信号通路在VADM和VANM两组间的差异,在术后7dVADM组的凋亡蛋白caspase-3,bid,bax和bak的mRNA或蛋白水平显著高于VANM组,caspase-8的mRNA和蛋白水平在术后3,7,14d显著高于VANM组,而线粒体凋亡通路中的抗凋亡分子bcl-2的mRNA和蛋白水平在术后7,14d显著低于VANM组.以上内容提示体内VA正常促进MSC移植治疗HIBD神经组织功能修复的可能机制是因为RA信号作用于TGF-β信号进而影响线粒体凋亡级联信号通路作用于神经细胞凋亡.(5) ATRA联合MSC培养对OGD损伤原代神经元凋亡影响：MSC处理各组凋亡率显著低于OGD组,MSCs+ 1μmol/LATRA处理的神经元OGD损伤后细胞凋亡率较其它处理组明显更低.MSC+ 1μmol/LATRA处理的神经元OGD损伤后线粒体膜电位异常率较其它处理组最低,而高浓度ATRA处理组线粒体膜电位异常率与OGD组无差异.以上结果提示适度RA刺激可显著促进MSC的抗凋亡作用,而高浓度可能抵消此效应.(6)可能机制：我们发现RARα的mRNA和蛋白水平与ATRA浓度存在剂量相关递增性,ATRA浓度越高则RARαα的mRNA和蛋白水平越高,MSC联合1μmol/LATRA处理组RARα表达处于中间水平,而且对照组的RARα 表达最低.神经元标志蛋白NSE的表达对照组最高,MSC处理各组NSE表达显著高于OGD组,其中MSC联合1μmol/LATRA处理组NSE表达较其他损伤组表达最高,OGD组NSE表达则最低.MSC处理各组的GDNF基因和蛋白表达显著高于OGD组,其中MSC联合1μmol/LATRA处理组GDNF表达较其他组表达最高.TGF-β1、2的表达MSC处理后较对照组升高,但低于OGD组,MSC联合1μmol/LATRA处理组TGFβ 1、2的表达则处于中间水平.我们深入检测了细胞线粒体凋亡信号通路的关键分子表达水平变化,MSC处理各组能显著降低凋亡信号分 子 caspase-3、 caspase-8、 bid、 bax、 bak的表达,而且MSC联合1μmol/LATRA处理组表达更低 ,而高浓度和无ATRA处理组表达则相对高于MSC联合1μmol/LATRA处理组；而MSC处理各组的抗凋亡分子bcl-2的表达显著高于OGD组,其中MSC联合1μmol/LATRA处理组表达最高,而高浓度和无ATRA 处理组表达则相对低于MSC联合1μmol/LATRA处理组.以上内容提示OGD损伤的神经元,MSC处理可显著抗凋亡,联合不同浓度ATRA刺激,发现在较低浓度时可促进MSC抗凋亡,高浓度或无RA刺激则抑制MSC 抗凋亡.提示有着一个最适的RA信号丰度扮演着抗凋亡作用,RA信号促进MSC抗凋亡可能是通过一个适宜的RA信言号丰度影响了GDNF,TGF-β信号.适宜的RA信号也导致了TGF-β信号维持在一适宜的水平进而通过影响线粒体凋亡信号通路实现促进MSC抗凋亡作用.结论：机体当处于适宜VA营养水平时可显著促进M SC移植治疗HIBD,可能的病理机制是适宜VA水平促进了极期的神经细胞新生和抑制了脑组织梗死萎缩并叠加了对MSC定植和活性的促进,其分子机制是适宜RA信号促进了适宜TGF-β信号和GDNF进而抑制线粒体凋亡通路级联表达并上调bcl-2表达从而抑制线粒体凋亡通路最终抑制了缺血缺氧损伤所致的细胞凋亡.这提示维持正常的VA水平内环境对MSC移植治疗HIBD修复有着良好的促进作用.