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目的：我们从前期的临床调查中发现浙江省猪群中流行三种猪源附红细胞体(Eperythrozoon 简称附红体)病原,猪附红细胞体(Mycoplasma suis MS)、小附红细胞体(Mycoplasma parvum MP)和未定种附红细胞体(Candidate Mycoplasma Haemosuis CMH),为了简化检测猪源附红体病原的方法,本研究建立了可以同时检测三种病原的二重PCR诊断方法并应用.方法：根据已扩增到的浙江省MS、MP和CMH的16S rRNA基因序列(序列号KC907396、JX489599和JX489601)的序列信息设计了6对引物,经过筛选,选取了2对引物MSF2(5TAAATTAAAGGAGGCTGCCGMAAGGTG 3)/MSR2(5TACGCCCAATAAATCCGGATAATGCTC 3)和 CMSF2(5AAACTCTGATGGTACCTCCTGAATAAGTGA 3)/CMSR2(5CCTTCGCTGGGGATGTCAAACCT 3),建立二重PCR检测方法并优化了反应条件,进行了特异性、敏感性和重复性试验.采用该法对浙江省2014年3-7月间16个猪场的80份血液样品进行了猪源附红体病原检测.结果：CMSF2/CMSR2和MSF2/MSR2两对引物置于同一个反应体系中PCR扩增,95℃预变性5min,94℃变性30sec,61.5℃退火30sec,72℃延伸30sec,共35循环,72℃后延伸5min.结果在400bp和500bp处有特异性的条带(如图1).测序结果证实为384bp的MP和MS序列片段,以及532bp的CMH序列片段,与预期相符.特异性试验表明只有M.suis/M.parvum和CMH模板可以扩增出特异性条带,猪丹毒杆菌、副猪嗜血杆菌、猪鼻支原体、猪滑液支原体、弓形虫等样品没有该条带.敏感性试验表明可以检测出CMH为300copy/μL的D NA,M.suis/M.parvum为30拷贝/μL的D NA.重复性实验结果相同,从而证明该检测方法具有很好的稳定性.用该法对2014年浙江省各地的16个猪场80份血液样品PCR检测结果显示有3个猪场为阴性,MS和MP阳性猪场12个,CMH阳性猪场为4个,总阳性率为38.3％.结论：本研究建立了同时检测三种猪源附红体的二重PCR检测方法,简化了检测步骤,该检测方法有良好的敏感性、特异性和稳定性,可以应用于猪源附红体病原的临床调查研究.