【摘 要】
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目的:研究HPV16 E6对宫颈癌C33A细胞中高迁移率族蛋白1体外释放的影响和机制.方法:构建并合成与HPV16 E6基因大小、长度一致的乱序序列基因真核表达质粒.经酶切鉴定后将空载体质粒、HPV16 E6高表达质粒、乱序序列重组质粒分别转染C33A细胞,RT-PCR验证转染48h后C33A细胞中三种目的基因的表达水平;MTT技术检测C33A细胞转染各组质粒48h前后存活率,及转染48h前后经不
【机 构】
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武汉大学中南医院妇瘤科,武汉430071
【出 处】
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第八届中国肿瘤学术大会暨第十三届海峡两岸肿瘤学术会议
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目的:研究HPV16 E6对宫颈癌C33A细胞中高迁移率族蛋白1体外释放的影响和机制.
方法:构建并合成与HPV16 E6基因大小、长度一致的乱序序列基因真核表达质粒.经酶切鉴定后将空载体质粒、HPV16 E6高表达质粒、乱序序列重组质粒分别转染C33A细胞,RT-PCR验证转染48h后C33A细胞中三种目的基因的表达水平;MTT技术检测C33A细胞转染各组质粒48h前后存活率,及转染48h前后经不同浓度HDAC1、LMB处理不同时间存活率;筛选合适浓度HDAC1、LMB分别作用各组细胞合适时间后以免疫荧光技术检测C33A细胞转染各组质粒48h前后HMGB1表达的亚细胞分布情况,Westernblot检测转染48h前后C33A细胞胞核、胞浆以及细胞培养液中HMGB1蛋白表达变化情况.
结果:RT-PCR验证空载体、HPV16 E6高表达质粒、乱序序列基因重组质粒均成功转入C33A细胞中，并在转染48h后在C33A细胞中表达。MTT法分析显示:随着HDAC1,LMB作用各组细胞浓度增加、时间增长，细胞存活率逐渐降低。依据MTT对细胞存活率的分析，选择long/mlHDC1及LMB分别作用于C33A细胞、转染空载体质粒、HPV16 E6高表达质粒、乱序序列基因重组质粒的C33A细胞24h后行免疫荧光和Westernblot检测。免疫荧光结果显示:HMGB1主要分布在C33A细胞胞核中;转染HPV16 E6质粒的C33A细胞中，胞核HMGB1表达量较对照组少，胞浆内表达量较对照组多;HDAC1激后，HMGB1从胞核向胞浆移位较对照组少。Westernblot显示:C33A细胞组、空载体组、LMB刺乱序序列基因组中，HMGB1胞核表达量较胞浆、上清液多，分别比较三组的胞核、胞浆表达量，其差异具有统计学意义(P<0.05);HPV16E6组HMGB1胞浆表达量明显高于胞核表达量，上清液HMGB1表达量高于其余3组(P<0.05)，且其HMGB1表达总量(胞核+胞浆+上清液)较其余3组多;与DMSO组比较，HDAC1,LMB刺激后，各组细胞HMGB1向胞浆移位减少，胞核、胞浆HMGB1表达量均具有统计学差异(P<0.05)。
结论:1)HPV16 E6可以诱导宫颈癌C33A细胞中HMGB1外释放;2)HPV16 E6可能通过激活HMGB1赖氨酸残基乙酞化途径出核;3)HPV16 E6诱导的C33A细胞HMGB1出核与核运输蛋白CRM1有关。
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