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目的:侵袭和转移是恶性肿瘤一个重要标志。基质金属蛋白酶((matrix metalloproteinases, MMPs)几乎在所有肿瘤中都有表达。头颈肿瘤中MMP1, MMP3, MMP9等高表达。本研究旨在寻找头颈肿瘤中高表达MMP新的调控基因，并对调控机制作进一步研究。
方法:构建上述MMPI，MMP3，MMPg启动子的报告基因质粒，通过比较报告基因的基础活性及PMA刺激后活性，确定MMP3一LuC作为第一轮高通量筛选的报告基因。对722个编码人类膜蛋白的候选基因质粒进行高通量筛选。高通量筛选发现GPR65对MMP一LuC有较强的激活作用。构建MMP3启动子截短体和突变体报告基因，利用双荧光素酶报告基因实验寻找GPR65家族在转录水平调控 MMP3的重要调控元件。构建携带GPR65的腺病毒载体，利用westem blot和酶谱试验对过表达GPR65的A549和FaDu细胞，检测MMP3，MMPZ和MMPg在蛋白和酶水平的变化。GPR65作为细胞膜表面感受氢离子的G蛋白偶联受体，通过酸刺激及其抑制实验以及MAPK通路蛋白水平的变化，探讨细胞外酸性环境通过GPR65调控MMP表达的下游通路。利用Transwell侵袭和细胞划痕实验细胞检测过表达GPR65的A549和FaDu细胞的侵袭和移动的能力。
结果:高通量筛选发现CPR65对MMP3启动子转录活性有较强激活作用的编码膜蛋白的基因。API(一64一70 bp)是MMP3启动子上GPR65调控其表达的重要元件。酸性环境下(pH 5.9)，GPR65能够介导MMP的表达，而且MAPK通路上磷酸化的ERK水平明显增高。肿瘤侵袭Transwell实验中过表达GPR65的A549细胞过膜的细胞数明显高于对照组。GPR4家族四个成员对于MMP诱导表达的能力有差异，其中GPR4和GPR65较强，GPR68相对较弱，而GPR132无诱导MMP表达的能力。
结论:GPR65和GPR4是MMP3表达重要的上游调控基因。是通过MAPKjAPI信号通路介导的，酸性环境下，GPR65能够介导MMP的表达，GPR65能够促进A549细胞的侵袭。低氧微环境增强喉癌细胞系肿瘤干细胞相关生物学特性杜怀栋，龚洪立，李大伟，田洁，周梁复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻咽喉头颈外科目的探索低氧微环境对喉癌细胞系肿瘤干细胞相关的生物学特性是否具有调控作用。方法采用低氧(1％02)及常氧(21%02)两种条件培养喉癌HeP一2及AMC一HN一8细胞系，比较这两种氧分压培养条件下喉癌肿瘤干细胞相关的生物学特性的差异，包括流式细胞仪检测细胞周期分布(GO/GI期细胞比例)，荧光实时定量PCR、westem blot及免疫细胞荧光检测干细胞相关调控基因(OCT4、SOXZ及NANOG)的mRNA及蛋白表达水平，流式细胞仪检测喉癌细胞系中CD133+干细胞亚群的比例改变，CCK一8实验检测喉癌细胞的体外增殖能力，Transwell实验检测喉癌细胞的基质胶侵袭能力，无血清培养基检测球体形成能力及平板克隆实验检测克隆形成能力。结果低氧能够明显增加HeP一2及AMc一HN一8细胞系中GO/GI期细胞的比例，在mRNA及蛋白水平增加OCT4、SOXZ及NANOG基因的表达水平以及增加这两个喉癌细胞系中CD133+干细胞亚群的比例;此外，低氧培养条件下的H叩一2及AMC一HN一8细胞系增殖能力较常氧条件下无明显统计学差异，然而低氧预处理48小时后重新放置于常氧培养条件的喉癌细胞系却表现出比常氧培养条件下明显增强的增殖能力、侵袭能力、球体形成及克隆形成能力。结论低氧微环境能够逆转部分处于非干细胞状态的喉癌细胞进人到处于相对静止期的干细胞样状态，从而增强喉癌细胞系肿瘤干细胞相关的生物学特性。