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奶牛泌乳是一个复杂的生理过程,是多种因素的协同作用的结果,受机体内各种分子的调控.miRNA是一类小分子非编码RNA,其主要作用是调节各种生理和病理过程.miRNA通过与mRNA的3UTR结合,抑制目的蛋白翻译或降解目的基因而起到调控作用.为深入了解奶牛乳腺在泌乳期差异表达miRNA,揭示miRNAs在乳腺泌乳过程中的调控作用及其作用机理,本研究利用本实验室前期测序获得的miRNA序列,订制miRNA芯片对荷斯坦奶牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织中差异表达的miRNA进行筛选,并通过比对两个时期中miRNA的表达情况,获得奶牛乳腺miRNA表达谱,同时使用荧光定量PCR技术对芯片结果进行验证.结果发现,泌乳期与非泌乳期奶牛乳腺对比,共筛选出差异表达miRNA共226个(P＜0.05),其中120个miRNA在泌乳期上调,106个miRNA表达下调.将筛选出的泌乳期特异miRNA用EGAN在线软件绘制网络图,获得这些miRNA和泌乳相关基因的相互关系.共有16个泌乳关键基因与37个差异miRNA有关,大部分基因与乳腺在泌乳期的功能有关,主要是与合成乳汁以及乳成分调控有关.根据芯片结果和网络图,随机选取7个miRNA(miR-125b,miR-133a,miR141,miR-181a,miR-199b,miR-484 and miR-500),验证其对相应基因的调控功能.采用RNA干扰技术对HK2、STAT5和ATP7b基因进行正反向调控,分别增加和减少miRNA在MAC-T细胞中的表达,用荧光定量PCR和Western Blot技术检测转染后MAC-T细胞中相关基因、蛋白的表达变化,发现miR-141抑制STAT5蛋白表达(P＜0.05)；miR-484和miR-500抑制HK2蛋白表达(P＜0.05),miR-125b,miR-181a和miR-199b对HK2蛋白表达调控作用不显著(P＞0.05)；同时miR-133a能促进ATP7b基因表达(P＜0.05).由此可见,这些差异表达miRNA对乳腺泌乳关键基因有调控作用.将差异miRNA和泌乳相关基因进行信号通路分析,有助于探索泌乳期乳腺中的各种分子事件.