【摘 要】
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本研究目的是构建PRRS诊断DNA微阵列.试验研究了靶基因克隆和靶基因与探针制备方法、靶基因杂交特异性和不同靶基因与探针浓度对杂交信号的影响,确定了构建PRRS诊断DNA微阵列靶基因和其最佳点样浓度、杂交条件和结果判断标准,结果为:1)应用RT-PCR从C14-2分离株和欧洲疫苗VP046扩增并克隆获得美洲型重组质粒C14P9(基因号:AY775132)、PRRSPS9(基因号:AY775134)
【机 构】
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四川农业大学动物科技学院,基因芯片实验室,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,雅安,625014
【出 处】
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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会
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本研究目的是构建PRRS诊断DNA微阵列.试验研究了靶基因克隆和靶基因与探针制备方法、靶基因杂交特异性和不同靶基因与探针浓度对杂交信号的影响,确定了构建PRRS诊断DNA微阵列靶基因和其最佳点样浓度、杂交条件和结果判断标准,结果为:1)应用RT-PCR从C14-2分离株和欧洲疫苗VP046扩增并克隆获得美洲型重组质粒C14P9(基因号:AY775132)、PRRSPS9(基因号:AY775134)、U1b(基因号:AY775135)、Y11(基因号:AY775133)、Y12(基因号:AY775136)和欧洲型基因重组质粒E6和E8.PCR法制备靶基因和探针纯化后的浓度分别为300-600ng/μL和200-400ng/μL;2)芯片杂交动力学研究认为杂交信号强度随靶基因和探针增加而增强,确定了最佳靶基因浓度为200ng/ul,探针适宜范围为3-3000pg/ul,系统灵敏性为3pg/ul.3)靶基因杂交特异性研究表明除个别靶基因在某一温度下存在交叉反应和杂交信号弱外,大多数靶基因在40-56℃下杂交信号强.采用AY775133、AY775134、E6和E8靶基因构建PRRS诊断DNA微阵列在40℃下预杂交1小时、48℃湿盒避光杂交6小时后经洗涤和扫读分析,杂交信号强、斑点明显、特异性高,按SNR≥1.5为标准能够区分PRRSV美洲型和欧洲型;4)应用PRRS诊断DAN微阵列检测了AMERVAC-PRRS、PRRSV弱毒疫苗、C14-2株、SCU株和临床样本,能正确区分PRRSV基因型.研究结果表明构建的PRRS诊断DNA微阵列可用于PRRS临床诊断和基因分型.
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