【摘 要】
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本研究建立了可同时检测大肠杆菌O157∶H7、金黄色葡萄球菌的活菌快速检测技术.根据大肠杆菌O157∶H7的wzy基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因设计特异性引物.双重PCR体系中的退火温度、引物、dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶浓度进行优化,在对活菌检测过程中,叠氮溴化丙锭(PMA)的浓度被进一步筛选.结果表明,总反应体系为25μL,其中10×PCR buffer 2.5μL,MgCl
【机 构】
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大连理工大学生命科学与技术学院 辽宁大连116024;大连民族大学生命科学学院生物化学工程国家民委-教育部重点实验室 辽宁大连116600
【出 处】
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中国食品科学技术学会第十二届年会暨第八届中美食品业高层论坛
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本研究建立了可同时检测大肠杆菌O157∶H7、金黄色葡萄球菌的活菌快速检测技术.根据大肠杆菌O157∶H7的wzy基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因设计特异性引物.双重PCR体系中的退火温度、引物、dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶浓度进行优化,在对活菌检测过程中,叠氮溴化丙锭(PMA)的浓度被进一步筛选.结果表明,总反应体系为25μL,其中10×PCR buffer 2.5μL,MgCl2(25mmol/L)3μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2.5μL,nuc引物浓度0.24 μμmol/L,wzy引物浓度0.16 μmol/L,DNA模板各1 μL,Taq DNA聚合酶为1U/μL,加ddH2O补充至25μL.反应程序为：95℃预变性3 min；94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸30s,32个循环；72℃终延伸10min. PMA浓度为1 2μg/ml时,可有效区分活菌和死菌.双重PCR同时检测两种活的致病菌的灵敏度达104cfu/mL.该方法可在15h-17h内完成对两种致病菌的检测,节省人工成本,避免假阳性结果.
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本研究建立了可同时检测单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌的双重PCR快速检测技术.根据单增李斯特菌的hly基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因设计特异性引物.对双重PCR体系中的退火温度、引物浓度、dNTPs添加量、MgCl2添加量、Taq DNA聚合酶添加量进行优化,对其灵敏度和特异性进行了验证.结果表明,双重PCR体系中(25μL),hly的引物浓度为0.2μmol/L,nuc的浓度为0.4μmol/L