【摘 要】
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目的 采用GatewayTM技术构建人Rb94基因重组腺病毒载体(Ad—hRb94).方法 从人类胚胎中提取总RNA,经逆转录得到目的cDNA,PCR扩增Rb94目的基因片段.设计含有attB侧翼序列的
【机 构】
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中国医学科学院放射医学研究所天津市分子核医学重点实验室
【出 处】
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第八次全国医学遗传学学术会议(中华医学会2009年医学遗传学年会)
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目的 采用GatewayTM技术构建人Rb94基因重组腺病毒载体(Ad—hRb94).方法 从人类胚胎中提取总RNA,经逆转录得到目的cDNA,PCR扩增Rb94目的基因片段.设计含有attB侧翼序列的引物,用于重组片段的PCR扩增,在BP重组酶的作用下,将含attB位点的PCR产物与受体载体pDONR～221发生重组反应,产生入门克隆.在LR重组酶作用下,将入门克隆与带attR1、attR2位点的目的载体Ad/CMV/V5一DEST体外重组形成表达克隆Ad—hRb94.经PCR和测序鉴定,将Ad—hRb94线性化后转入293A细胞进行病毒的包装、扩增及病毒滴度测定.结果 经PCR和测序证实目的基因Rb94片段按正确方向重组入目的载体中,带Rb94基因的目的载体在293A细胞中包装成功,获得高滴度的病毒颗粒,滴度为9.41×1010pfu/ml.结论 本实验利用GatewayTM技术成功构建了Ad-hRb94,为进一步进行肿瘤基因治疗研究奠定了实验基础.
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