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目的 有机磷农药(organophosphorus pesticides,OPs)可引起慢性神经毒性症状,主要表现为轻度的认知功能障碍及抑郁等情感障碍.这些症状可称作慢性有机磷诱导的精神障碍(chronic OP-induced neuropsychiatric disorder,COPIND),或有机磷诱导的慢性神经毒性(organophosphorus ester-induced chronic neurotoxicity,OPICN).不但OPs中毒的病人可出现COPNID症状,受OPs长期轻度暴露无明显急性中毒症状的人也可产生COPIND症状.目前COPIND的作用机制还不清楚.COPIND持续时间很长,Rosenstock等对OPs中毒2年后的农民进行研究,发现其对语言与视觉的注意力表现很差,视觉记忆、视觉运动速度、排序与解决问题的能力等都下降.Wesseling等发现,2年前曾发生过轻度有机磷中毒的工人其认知功能与神经运动功能发生障碍.COPIND的这种长期性,提示中枢神经系统发生了永久性损伤.COPIND具有迟发性,多发生在急性中毒症状消失以后,并与急性毒性无直接关系,受OPs轻度暴露没有急性中毒症状的人员其慢性神经毒性发生率也较高.Stephens等研究发现,给羊进行OPs药浴除虫的工人,在OPs暴露后的近期仅出现轻度的神经症状,而在脱离OP暴露2个月后神经障碍症状明显.Bazylewicz-Walczak等发现在温室工作而接触OPs的女工在工作季节情绪与神经功能检测未见明显变化,而在工作季节结束约一个月后,则会出现抑郁、疲劳等症状.COPIND表现持续时间长及迟发性等特点,提示COPIND可能不完全源于OPs的直接毒性作用.实验发现了与流行病学调查相似的结果.一些研究发现,实验动物认知功能障碍可在OPs停止暴露后持续数天至数月.Sanchez等发现,毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)染毒后22周的动物,在水迷宫试验中仍表现不佳.Dufffy与Burchfiel发现,在沙林染毒后一年,猕猴的脑电图仍不正常.一些研究也发现神经毒性具有迟发性.Song等发现神经毒性在OPs暴露结束几天后方出现.Prendergast等发现工作记忆损伤出现在OPs暴露结束后,与胆碱酯酶活力活复有关.残杀威是氨基甲酸酯类化合物,具有与OPs相似的作用机制,Schmuck与Mihail等在对残杀威的体外研究中发现,残杀威染毒7天,细胞未出现明显的毒性,而在残杀威撤除后,细胞却显示出明显的毒性.尽管目前已有大量的实验数据证实OPs可以导致迟发的、持续时间很长的精神障碍症状,然而其相关机制还不清楚.为研究有机磷慢性神经毒性的作用机制,本课题重点研究了有机磷农药毒死蜱连续染毒与染毒一段时间后撤除对海马神经元的毒性作用与机制,以及海马神经元对毒死蜱的耐受作用,为有机磷农药的慢性神经毒性作用机制研究提供理论依据；并研究了氨基甲酸酯农药克百威预处理对毒死蜱细胞毒性的影响及作用机制,以及氧化应激在该过程中的作用,为评价氨基甲酸酯农药与有机磷农药联合作用提供依据.方法与结果：①毒死蜱撤除引起的海马神经元毒性与ERK1/2磷酸化抑制及胆碱能不足有关.有机磷农药诱导的OPICN具有迟发性,并持续很长时间,机制不明.为探讨这种慢性神经毒性相关作用机制,我们研究了CPF撤除后对原代培养海马神经元的毒性作用及相关机制.结果显示,10μM CPF连续染毒达96h未产生明显细胞毒性,但在染毒48h后将CPF撤除,却导致了明显的细胞毒性,表现为撤除CPF后24h或48h(自染毒开始计算时为72h与96h),神经元MTT代谢降低,神经元缺失增加,TUNEL阳性细胞增加.在机制研究中发现,10μM CPF染毒对神经元AChE活性产生抑制作用,在CPF撤除后,AChE活性轻度升高,提示由CPF撤除引起的细胞毒性不是胆碱酯酶抑制的直接结果.CPF染毒可激活ERK1/2,在CPF存在的情况下,这种激活作用可持续几个小时,以后逐渐恢复正常.在染毒48h,ERK1/2已恢复正常,此时将CPF撤除,ERK1/2激活却受到抑制.通过研究ERK1/2激动剂氨甲酰胆碱与NGF及ERK1/2拮抗剂阿托品与PD98059对CPF撤除导致细胞毒性的影响及对ERK1/2激活的影响,证实抑制ERK1/2激活在CPF撤除导致的细胞毒性中起重要作用.氨甲酰胆碱是一种胆碱能激动剂,而阿托品是胆碱能拮抗剂,两者对CPF撤除后细胞毒性的影响提示CPF撤除引起了胆碱能不足.由此表明,在连续染毒过程中无直接细胞毒性浓度的CPF在染毒一段时间后撤除导致了细胞毒性,这种CPF撤除导致的细胞毒性与CPF的直接毒性作用无关；在CPF撤除后的ERK1/2磷酸化反应与胆碱能活性都与CPF染毒期间作用相反,提示CPF撤除后可能引起了戒断症状(与原发作用机制相反的症状),该结果有助于解释OPs的慢性神经毒性作用机制.②海马神经元对毒死蜱的耐受作用研究.以上结果表明,无细胞毒性浓度的毒死蜱染毒一段时间后撤除可以导致细胞毒性,并提示这种毒死蜱撤除引起的细胞毒性与胆碱能不足有关,有机磷农药可能会产生戒断毒性.由于耐受作用是戒断作用的前提,为进一步探讨有机磷农药的毒性作用机制,有必要对有机磷农药的耐受作用进行深入研究.我们采用无细胞毒性浓度(10μM) CPF对培养海马神经元预处理染毒48h,再经较高浓度的CPF(30,60,100μM)染毒48h,通过测定细胞存活率、LDH漏出率以及TUNEL阳性细胞率,比较是否CPF预处理一段时间可以降低较高浓度CPF对细胞的毒性作用.结果表明,经10μM CPF预处理组比未经预处理组细胞存活率上升、LDH漏出率下降、TUNEL阳性细胞率下降,表明经预处理的细胞对较高浓度的CPF产生了耐受作用.由于耐受性是戒断作用的前提,本研究进一步提示毒死蜱撤除引起的细胞毒性作用是一种戒断作用,提示有机磷农药导致的慢性神经毒性可能与戒断作用有关.③氨基甲酸酯农药克百威预处理对有机磷农药CPF神经细胞毒性的影响.农业生产中大量使用有机磷农药与氨基甲酸酯农药,使得人类暴露于这两类农药的机会增加,尤其是可在不同时间暴露于这两类农药,从而产生联合作用.为探讨这两类农药的联合作用与机制,我们研究了氨基甲酸酯农药克百威预处理对有机磷农药CPF神经细胞毒性的影响.采用噻唑蓝(MTT)法测定克百威对原代培养皮层神经细胞存活率的影响,找出无细胞毒性的较高浓度；采用无毒浓度的克百威对培养细胞进行不同时间的预处理,再经CPF染毒48h后测定细胞毒性变化；采用Western blot方法测定克百威不同时间预处理对毒死蜱激活ERK1/2作用的影响.结果表明,10μmol/,克百威染毒72h显示无细胞毒性,10μmol/L克百威预处理(2～24h)可减轻60μmol/L CPF的毒性,预处理8h作用最强：克百威预处理降低了CPF对ERK1/2的激活作用,抑制ERK1/2激活作用与细胞毒性减轻相关.而克百威与CPF同时染毒(预处理0h) CPF的细胞毒及ERK1/2激活影响很小,由此表明,克百威预处理一段时间后可拮抗CPF的细胞毒性,作用机制与抑制ERK1/2激活有关,而克百威预处理时间过短,则不产生拮抗作用,提示氨基甲酸酯农药与有机磷农药之间的联合作用模式受两者染毒时间间隔影响.④克百威预处理对毒死蜱致皮层神经细胞氧化应激作用的影响.在前面的研究中,10μM克百威对皮层神经细胞预处理8h可显著减轻毒死蜱的细胞毒性,由于氧化应激作用与农药的毒性有关,本部分实验探讨氧化应激在该过程中的作用,以进一步揭示有机磷农药与氨基甲酸酯农药联合作用的机制.本实验测定了10μM克百威对皮层神染毒8h对脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的影响,以及10μM克百威对皮层神经细胞染毒8h后染毒不同浓度毒死蜱(20、40、60、80μM)染毒24h对上述氧化应激指标的影响.结果表明,克百威在染毒8h后,可使MDA轻度增加,SOD、GSH-Px活性升高,GSH无显著变化.毒死蜱染毒可使皮层神经细胞MDA水平增加,GSH水平下降,SOD、GSH-Px活性下降,呈现明显的浓度-效应关系,与正常对照组比较具有显著差异,表明毒死蜱可使神经细胞产生明显的氧化应激作用.克百威预处理对毒死蜱所致氧化应激作用产生影响,与未经毒死蜱预处理组比较,克百威预处理组MDA下降,GSH水平有所升高,SOD、GSH-Px活性升高,表明经克百威预处理的细胞对毒死蜱的氧化损伤具有抵抗作用.本实验克百威预处理拮抗了毒死蜱的脂质过氧化损伤作用,作用机制可能与克百威诱导产生轻度的氧化应激作用,在产生轻度过氧化损伤导致MDA升高的同时,增强了细胞的抗氧化能力有关,提示氧化应激作用参与了农药之间的联合作用机制.结论①CPF可诱导海马神经元的耐受作用,无毒性作用浓度的CPF在染毒一段时间后撤除可产生细胞毒性,这种CPF撤除所致细胞毒性作用与ERK抑制及胆碱能不足有关,提示有机磷的慢性神经毒性可能与戒断作用有关；②无细胞毒性作用浓度的克百威预处理一段时间后可以拮抗毒死蜱对神经细胞的毒性作用,作用机制与克百威预处理可以抑制毒死蜱的ERK1/2激活作用,以及减轻了毒死蜱所致氧化应激作用有关.国家科技支撑计划课题(2006BAK02A02)与国家自然科学基金课题(30800929)资助.