【摘 要】
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目的：利用TaqMan探针建立熔解曲线定量分析技术平台,比较TaqMan探针熔解曲线技术与变性高效液相色谱技术(DHPLC)及测序技术检测线粒体DNA 1555A＞G异质性突变水平的优劣.方法：克隆及构建线粒体DNA 1555A＞G野生型和突变型质粒,并利用ABI 3130测序仪测序验证.将质粒稀释至工作浓度,利用相同浓度1555A＞G野生与突变质粒按不同体积比例构建0％,10％,20％,30％,
【机 构】
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暨南大学第二临床医学院,深圳市人民医院 深圳518020 亚能生物技术(深圳)有限公司 深圳518
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目的：利用TaqMan探针建立熔解曲线定量分析技术平台,比较TaqMan探针熔解曲线技术与变性高效液相色谱技术(DHPLC)及测序技术检测线粒体DNA 1555A＞G异质性突变水平的优劣.方法：克隆及构建线粒体DNA 1555A＞G野生型和突变型质粒,并利用ABI 3130测序仪测序验证.将质粒稀释至工作浓度,利用相同浓度1555A＞G野生与突变质粒按不同体积比例构建0％,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％十一个不同突变负荷的标准品备用.建立TaqMan探针熔解曲线技术,采用SLAN-96S Real Time System,置50000copies的0％,10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％十一个不同突变负荷的标准品于反应体系中,按照优化的反应条件将获得的熔解曲线作为标准曲线.定量氨基糖苷类药物性耳聋大家系及正常人群的线粒体DNA 1555A＞G异质性突变水平,采用SPSS13.0软件Scatter散点图功能分析标准品熔解曲线与突变负荷关系,根据散点图的图形分布做统计学析并求出定量突变负荷的函数.将其结果与前期采用DHPLC技术及测序技术的检测结果进行对比分析.结果：TaqMan探针熔解曲线技术成功分析50例样本的线粒体DNA 1555A＞G突变水平,相比于Sanger测序技术多发现1例异质性突变,但比DHPLC技术少发现3例异质性突变.结论：本实验建立的TaqMan探针熔解曲线技术成功检出19％至86％范围内的线粒体DNA 1555A＞G异质性突变水平,灵敏度较测序技术高但比DHPLC方法低.
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