【摘 要】
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目的 由于hESC(人胚胎干细胞)具有无限增殖能力和多向分化潜能,使其成为再生医学领域和基因治疗领域强有力的研究工具.我们利用核糖体基因区打靶载体(pHmeo),携带hFⅧ打靶hESC,为血友病A实现个体化的基因治疗提供重要的参考.方法 将携带hFⅧ的核糖体基因区打靶载体(pHmeo-hFⅧ)采用电转的方式,转染人胚胎干细胞系H9,经G418筛选后,通过PCR及Southern Blot鉴定获得定
【机 构】
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中南大学医学遗传学国家重点实验室,中国湖南,长沙,410078
【出 处】
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中华医学会2012年医学遗传学年会暨全国第十一次医学遗传学学术会议
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目的 由于hESC(人胚胎干细胞)具有无限增殖能力和多向分化潜能,使其成为再生医学领域和基因治疗领域强有力的研究工具.我们利用核糖体基因区打靶载体(pHmeo),携带hFⅧ打靶hESC,为血友病A实现个体化的基因治疗提供重要的参考.方法 将携带hFⅧ的核糖体基因区打靶载体(pHmeo-hFⅧ)采用电转的方式,转染人胚胎干细胞系H9,经G418筛选后,通过PCR及Southern Blot鉴定获得定点整合hFⅧ的hESC克隆.再对整合的ES克隆进行核型分析、AP染色、免疫荧光、EB小体分化,畸胎瘤形成等实验鉴定.由于hFⅧ的主要合成器官为肝脏,我们通过在培养基中加入Activin A,HGF,FGF4等特定的诱导因子,将整合hFⅧ的hESC克隆定向诱导成肝细胞,并通过RT-PCR鉴定肝细胞特异性标志基因及外源hFⅧ的表达,Elisa测定hFⅧ蛋白的浓度.结果 定点整合PCR及Southern Blot检测到特异性片段,表明pHmeo成功介导hFⅧ定点整合至hESC.整合后的hESC核型正常,为46,XX；AP染色阳性,多潜能性特异标志基因SSEA-4,TRA-1-60等表达阳性；体外EB分化及体内畸胎瘤形成后,均能检测到向三个胚层分化.定向诱导成肝细胞后,RT-PCR能检测到AFP,Alb,AAT等肝细胞的标志基因以及外源hFⅧ的转录.细胞培养上清中的Elisa结果显示hFⅧ蛋白可以在分化后的肝细胞中合成并分泌.结论核糖体基因区打靶载体能有效地介导hFⅧ打靶hESC,且打靶后的hESC仍具备多向分化潜能,为pHmeo-hFⅧ应用于ex vivo策略的血友病A基因治疗奠定了重要的基础.
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