【摘 要】
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目的：构建携带human-VEGF165基因的慢病毒载体,转染嗅鞘细胞(OECs),探索将human-VEGF165基因导入OECs的方法,分析构建OECs-VEGF基因工程细胞的可行性.方法：差速贴壁法纯化O
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目的：构建携带human-VEGF165基因的慢病毒载体,转染嗅鞘细胞(OECs),探索将human-VEGF165基因导入OECs的方法,分析构建OECs-VEGF基因工程细胞的可行性.方法：差速贴壁法纯化OECs,采用免疫荧光鉴定OECs原代细胞纯度.使用慢病毒包装试剂盒,通过三种质粒的共同转染293T 细胞,合成携带目的基因的慢病毒载体.荧光实时定量PCR 法测定病毒滴度,采用免疫荧光检测和ELISA检测OECs-VEGF165基因工程细胞.结果：差速贴壁法所取出的原代细胞约在所有细胞中占98％,第二代约占78％,第三代降至58％,活性也明显下降,细胞形态变得多种多样,增殖变缓.从质粒转染成功的293T细胞提取的蛋白中检测到22KD附近处有条带,其大小和目的基因合成的蛋白分子量相吻合.合成病毒的滴度为2×108个/ml.转染组GFP阳性细胞数占总细胞数的比例大于80％,转染后MOI为5亚组细胞死亡较少,细胞功能恢复快.转染成功的OECs观察到外源VEGFA的表达.结论：差速贴壁法纯化是简便、经济的体外研究OECs的方法,要选择合适的传代次数.通过携带有human-VEGF165基因的慢病毒载体感染OECs,构建出的human-VEGF-OECs基因工程细胞可稳定、高效表达VEGF165基因,合成的目的蛋白分泌到细胞外.
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