【摘 要】
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本文主要研究以酶催化的原理为基础设计酶定向进化的实验方法。青霉素酰化酶不仅可以水解还可以进行动力学缩合反应合成一系列 内酰胺抗生素,扩大青霉素酰化酶的底物特异
【机 构】
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大连工业大学生物工程学院 大连市甘井子区轻工苑1号,116034
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本文主要研究以酶催化的原理为基础设计酶定向进化的实验方法。青霉素酰化酶不仅可以水解还可以进行动力学缩合反应合成一系列 内酰胺抗生素,扩大青霉素酰化酶的底物特异性是其定向进化的目标。同仅仅有亲和能力的蛋白质不同,酶将亲和的底物转变为产物；体外定向进化的策略是偶联基因-蛋白-底物(或产物),如果分割酶的识别部位和催化部位,将可能利用酶对底物的识别和亲和能力进行酶对底物特异性的进化。克隆青霉素酰化酶基因于噬菌体 fd-Dog,同表面蛋白 pⅢ 融合表达在噬菌体表面。青霉素酰化酶Asn B241 残基是催化二联体,对 B241 定点诱变表明同对底物的亲和性 KM相比,酶的转换数 Kcat下降较大,提示可以关闭酶对底物的转化而保持对底物的亲和,因此将对环境变化敏感的蛋白质巯基的荧光探针acrylodan 插入青霉素酰化酶 B240,进入催化口袋的底物导致荧光猝灭,同时得到了基因-酶-底物的偶联体,这样就建立了一种新型体外酶定向进化的方法。
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