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目的：细胞周期阻滞、抑制细胞增殖或诱导肿瘤细胞死亡是抗肿瘤药物的主要作用方式.本课题组前期在对中国产藤黄属植物进行筛选研究中发现,从植物大苞藤黄中分离得到的化合物Isobractatin(YPA)对细胞自噬与凋亡均有一定的调节作用.本项目将在此基础上进一步对YPA 调控周期阻滞的作用机制进行研究.方法：1.阐明YPA 对细胞自噬的影响.1)采用荧光显微镜成像的方法在稳定表达GFP-LC3 蛋白的HeLa 细胞株上通过观察GFP-LC3 小点的数目,初步判断YPA 对自噬信号通路的调节作用.2)采用western blot 方法检测YPA 不同时间、浓度下对p62 以及LC3B-II表达的影响.3)加入自噬抑制剂Hydroxychloroquine(HCQ)、Bafilomycin(Baf-A1)与凋亡相关的caspase 抑制剂Z-VAD-FMK,采用PI 染色结合流式细胞术的方法检测YPA 对细胞自噬与凋亡的影响.2.探究YPA 对HeLa 细胞周期的调控作用及其机制.1)采用流式细胞术的方法观察YPA 对细胞周期的影响.2)用Thymidine 与Nocodazole 两个药物将细胞分别同步化到G0/G1 以及G2/M 期,将两者撤去后,加入YPA 处理不同时间点,进一步观察YPA 对处于G0/G1 及G2/M 期细胞的影响.3)转录因子E2F 在DNA 复制以及细胞从G1期进入S 期过程中起到非常关键的作用,将含有E2F 的报告质粒转染到HeLa 细胞株中,采用luciferase assay 检测YPA 对E2F 转录活性的影响.4)采用Western blot 以及RT-PCR 的方法检测YPA 对Rb,E2F 及其转录下游的相关周期蛋白在mRNA 以及蛋白水平的表达.4)纺锤丝的正常形成是细胞有丝分裂过程发生的前提条件.将含有YFP-Tubulin 的质粒载体转染到HeLa 细胞中,采用Nocodazole 将细胞周期同步到G2/M 期后,加入YPA,在荧光显微镜下观察药物对有丝分裂纺锤丝的影响.结果：1.YPA 对细胞自噬的抑制作用：荧光显微镜下观察到YPA 可诱导GFP-LC3 荧光小点的增加,同时,在不同时间(24,48 小时)以及不同浓度(5μM,2μM)下使自噬相关蛋白LC3II 及p62 表达升高,这一结果表明YPA 可能是自噬抑制剂.加入凋亡抑制剂Z-VAD-FMK 后,流式结果显示,由YPA 引起的sub-G1 峰从24.2％下降至3.5％,而加入自噬抑制剂HCQ 以及Baf-A1 后,sub-G1 峰明显升高.综上,YPA 可以通过抑制细胞自噬,诱导细胞凋亡致使细胞死亡.2.YPA 对细胞周期的阻滞作用：流式结果显示,YPA 仅引起sub-G1 峰的增加,对整个细胞周期没有较明显的影响,采用细胞周期同步化后,YPA 可以抑制G0/G1 期以及G2/M 期的HeLa 细胞回到正常的细胞周期.进一步探究YPA 对G0/G1期细胞的阻滞作用,luciferase 实验结果表明,YPA 能够在短时间内较为明显地抑制转录因子的活性.western blot 以及RT-PCR 相应检测到磷酸化Rb,E2F1 以及其转录下游的周期蛋白cyclin E 与cyclin A 的表达水平下降,p21 的表达显著升高.有关YPA 对G2/M 期细胞的影响,荧光显微镜下观察到YPA 能够在较短时间内抑制有丝分裂期间tubulin 的形成.结论：结果显示,YPA 能够抑制自噬,诱导细胞凋亡.同时通过抑制G1 期到S 期细胞进程的关键转录因子E2F 的活性以及有丝分裂期期间纺锤丝的形成,阻滞G0/G1 及G2/M期的HeLa 细胞重新回到细胞周期.其具体影响E2F 转录因子以及抑制纺锤丝形成的机制研究仍在进一步探索中.