【摘 要】
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柑橘果实的转色过程对其外观品质和营养价值至关重要.基于此,本研究拟克隆调控柑橘果实转色的关键基因STAY-GREEN(SGR),并对其在柑橘果实转色过程中的功能进行分析,以期深入探究柑橘果实转色的分子机理,为未来利用分子辅助育种手段进行柑橘育种和品质改良奠定理论基础.利用同源序列法,对滞绿基因STAY-GREEN(SGR)的DNA和cDNA序列进行TA克隆和测序分析；利用MEGA 5.2软件进行进
【机 构】
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华中农业大学园艺林学学院,园艺植物生物学教育部重点实验室,武汉430070
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柑橘果实的转色过程对其外观品质和营养价值至关重要.基于此,本研究拟克隆调控柑橘果实转色的关键基因STAY-GREEN(SGR),并对其在柑橘果实转色过程中的功能进行分析,以期深入探究柑橘果实转色的分子机理,为未来利用分子辅助育种手段进行柑橘育种和品质改良奠定理论基础.利用同源序列法,对滞绿基因STAY-GREEN(SGR)的DNA和cDNA序列进行TA克隆和测序分析；利用MEGA 5.2软件进行进化树分析；基因表达分析采用实时荧光定量PCR法；利用烟草瞬时表达体系、工程菌、愈伤组织遗传转化等方法分析其生物学功能；利用双分子荧光互补技术(BIFC)验证其与柑橘八氢番茄红素合成酶(CsPSY)的互作.对柑橘滞绿基因STAY-GREEN(SGR)进行克隆和功能分析,获得了以下结果：1)发现柑橘中SGR存在两个同源基因,分别将其命名为CsSGR和CsSGRL.2)进化树分析表明,SGR的两个同源基因分属于两个亚族,CsSGR属于SGR家族,而CsSGRL属于SGR-LIKE家族,且其中SGR基因的进化相对保守.3)RT-PCR表达分析表明,CsSGR在不同柑橘品种中均有表达,且均在果实破色期表达量最高,相反,CsSGRL在不同柑橘品种、不同发育时期和不同组织中的表达量均极低,表明CsSGR在柑橘果实转色过程中发挥着重要作用.此外,CsSGR能在非绿色组织果肉中表达,暗示其在类胡萝卜素积累过程中也可能发挥作用.同时还发现CsSGR和CsPSY存在共表达现象,两者可能存在互作.4)烟草瞬时表达实验表明,超表达CsSGR能使烟草叶片褪绿,进一步测定其中的叶绿素含量后发现其叶绿素含量显著降低,证实CsSGR具有降解叶绿素的功能.5)工程菌实验表明,超表达CsSGR能使积累番茄红素的红色工程菌和积累β-胡萝卜素的黄色工程菌均褪色,测定其中的类胡萝卜素含量后发现其类胡萝卜素含量显著降低,说明CsSGR对类胡萝卜素的合成具有抑制作用.6)CsSGR在柑橘愈伤组织中超量表达后,能使富含类胡萝卜素的愈伤组织褪色,转基因愈伤系中类胡萝卜素含量显著降低,进一步证实了CsSGR对类胡萝卜素合成的抑制作用.7)BIFC实验结果表明,CsSGR和CsPSY存在互作,CsSGR可能是通过与CsPSY的互作来参与调控柑橘果实类胡萝卜素的合成.综上,本研究对柑橘滞绿基因STAY-GREEN(SGR)进行了克隆和功能分析,解析了CsSGR在柑橘果实转色过程中所发挥的功能,部分阐述了柑橘果实转色的内在分子机制,但其调控柑橘果实转色的分子机理和调控网络有待后续深入研究.
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