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目的：观察胰岛素受体底物-1表达受阻对小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化和PPARγ表达的影响。
方法：针对小鼠IRS-1基因开放阅读框上的2个区域合成shRNA(M和MH),以pGenesil-1 vector为载体构建带绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)靶标的shRNA质粒。以脂质体Lipofectamin TM 2000介导转染3T3-L1前脂肪细胞,并设阴性对照(HK)载体转染组。细胞转染后,G418筛选稳定表达的阳性克隆并通过Western blot鉴定。应用3-异丁基-1-甲基黄噤呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,lBMx)0.5mM,地塞米松(Dexamethasone,DEX)10-6M和胰岛素(Insulin,Ins)5 μg/mL分别诱导小鼠3T3-L1前脂肪细胞空白对照组、阴性对照(HK)载体转染组、M和MH转染组分化,在诱导分化的不同时间点收集细胞。用Western Blot检测PPARγ的表达。脂肪细胞内脂滴用油红O染色观察。
结果：与空白对照组、阴性对照组和转染M组IRS-1 shRNA质粒的3T3-L1前脂肪细胞相比,转染MH组IRS-1shRNA质粒的3T3-L1前脂肪细胞IRS-1蛋白表达水平降低70％以上;而MH转染组细胞PPARY蛋白的表达与前三组3T3-L1前脂肪细胞比较无改变。前三组3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞成功，PPARy蛋白的表达存脂肪细胞分化成熟过程中逐渐增高，油红O染色显示，随着脂肪细胞的分化成熟，桔红色脂滴逐渐增多；而转染MH组IRS-1 shRNA质粒的3T3-L1前脂肪细胞经诱导，油红O染色桔红色脂滴显著减少，直到分化的第8天，才见少许桔红色脂滴，且PPARγ蛋白的表达无变化。
结论：IRS-1基因沉默后可抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化，并在分化过程中抑制PPARγ的表达,说明IRS-1通过调节PPARγ的表达或与PPARγ共同作用在3T3-L1前脂肪细胞的分化中发挥决定性作用。