【摘 要】
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本课题的目的是构建全人源白血病噬菌体单链抗体库,并从中筛选出与白细胞分化抗原CD33胞外区蛋白特异结合的单链抗体,表达单链抗体scFv蛋白,并对其进行鉴定分析.通过分离
【机 构】
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浙江大学医学院生化系,杭州310058
【出 处】
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2015中国转化医学大会暨中国转化医学联盟成立大会
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本课题的目的是构建全人源白血病噬菌体单链抗体库,并从中筛选出与白细胞分化抗原CD33胞外区蛋白特异结合的单链抗体,表达单链抗体scFv蛋白,并对其进行鉴定分析.通过分离白血病病人外周血淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR合成cDNA第一链,使用32条引物PCR扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因.使用重叠PCR(SOE-PCR),将VH和VL基因通过linker连接成单链抗体(scFv)基因,再重组至噬菌粒载体pCANTAB-5E中,转化至E.coli TG1,经辅助噬菌体超感染,构建全人源白血病噬菌体单链抗体库,挑取20个单克隆送测序；PCR扩增急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞表面高表达抗原CD33的胞外区基因,插入质粒pET28a(+),转化至表达菌E.coli Rosetta,表达出CD33胞外区蛋白.将CD33胞外区蛋白结合于96空ELISA板,单链抗体库与其孵育后,经多次洗涤、洗脱、扩增噬菌体单链抗体,进行4轮富集筛选；选取第四轮筛选后的菌落制备单克隆噬菌体抗体,测序正确的进行ELISA特异性鉴定和免疫荧光鉴定；选取阳性值最高的单链抗体噬菌体侵染E.coli HB2151,经IPTG诱导表达可溶性scFv蛋白,用蛋白印迹的方法鉴定scFv蛋白.结果表明：构建出库容为1.5×109的噬菌体单链抗体库,测序后序列经分析证明scFv基因片段插入率达99％,抗体库多样性良好.噬菌体抗体库经4轮筛选后,结果显示富集了100倍.经ELISA验证、并测序后,共获得7株与CD33较强特异性结合的噬菌体抗体并表达获得可溶性scFv抗体蛋白,为白血病的诊疗打下基础.
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