【摘 要】
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本研究的目的是利用多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌.根据单增李斯特菌的hly基因、
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本研究的目的是利用多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌.根据单增李斯特菌的hly基因、沙门氏菌的invA基因和金黄色葡萄球的Smal基因筛选并设计了三对特异性引物.对多重PCR反应体系中的引物浓度、Mg2浓度、Taq酶浓度以及反应程序中的退火温度进行了优化.最终确定：反应体系为50μL,其中10×PCR buffer 5μL,MgCl2 (25mmol/L) 4μL,dNTPs (2.5mmol/L) 4μL,沙门氏菌的引物浓度5 μmol/L,金黄色葡萄球菌的引物浓度20 μ mol/L；单增李斯特菌的引物浓度20 μ mol/L,DNA模板各2μL,Taq酶(1.25U/μL) 2.5μL,加ddH2O补充至50μL；反应程序为：95℃预变性3min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸45s,进行32个循环,72℃后延伸10min.对三种食源性致病菌进行特异性及灵敏性实验,结果表明该反应体系具有较好的特异性,最低检出限为104cfu/mL,检测时间为3小时.最终建立了能够同时、简便、快速及高灵敏性的检测沙门菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的多重PCR方法.
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