猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测的建立

• 作 者: 王东方[1]拜廷阳[2]吴志明[2]闫若潜[2]赵明军[3]李文山[2]赵雪丽[2]王淑娟[2]刘梅;
• 机 构: 周口市畜禽改良站,河南周口,466000
• 出 处: 河南省畜牧兽医学会第八届会员代表大会暨2013年学术研讨会
• 发表日期: 2013年期

建立一种特异、灵敏、快速检测猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR方法.根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine Cytomegalovirus,PCMV)DNA序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立了猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR),进行了FQ-PCR检测方法的敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PCMV感染临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了比对;对FQ-PCR检测结果为PCMV阳性猪的不同内脏器官进行病毒含量比较检测.成功建立了PCMV的FQ-PCR方法,标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;检测灵敏度可达1拷贝/μL,是常规PCR的100倍;特异性高,对pGEM-T/PCMV重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对6个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEM-T/PCMV重组质粒分别重复扩增6次,重复结果良好;对15份临床疑似PCMV感染的组织病料进行应用检测表明,其中有9份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100％.猪的内脏器管中PCMV含量最高为扁桃体,最低的为小肠.成功建立了PCMV FQ-PCR方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊和隐性感染猪的早期检测,对PCMV的快速诊断、综合防控及净化等具有重要意义.