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背景:癌症是目前全世界导致人类死亡的第二大原因,目前临床上治疗肿瘤的最重要手段仍是放、化疗.众所周知,大部分的放、化疗对骨髓都有一定的抑制作用,治疗中常严重的降低白细胞,致使机体免疫功能降低,病人继发感染,最终导致治疗失败.因而,许多良好的治疗方案不能够继续,增加了肿瘤病人的死亡率.防治骨髓抑制,加快放、化疗后机体免疫系统的重建,是保证恶性肿瘤放、化疗效果的关键.随着造血干细胞的分离纯化方法进展,CD34+造血干细胞是目前所研究的最早期的造血细胞,它可以在细胞内外环境的刺激下,在细胞因子的作用下向各系分化成熟为功能细胞.千金藤(cepharathine)是一种双苄基异喹啉类生物碱,是从防己科千金藤属植物中提取分离出来的,经半合成为盐酸千金藤碱,其具有消炎、抑菌、调节免疫功能等作用,本研究在体内造成白细胞降低模型,证实了盐酸千金藤碱的升白效果,并从体内外两个方面探讨了其升白机制与促进骨髓CD34+造血干细胞增殖的关系,并初步观察了其辅助化疗的作用,为盐酸千金藤碱的进一步开发研究提供了理论依据。
方法:实验采用动物移植性肿瘤肝癌H22细胞皮下移植模型,观察不同浓度的CH预防和治疗环磷酰胺造成的白细胞降低的药效学实验.体外实验采用分离纯化骨髓有核细胞,在抑制干细胞分化的同时加入不同浓度的CH进行培养,测定CH在体外对骨髓CD34+造血干细胞增值的影响;体内实验用环磷酰胺(CTX)造成荷H22细胞小鼠白细胞降低模型,观察不同浓度的CH预防和治疗由CTX所致白细胞减低小鼠骨髓有核细胞及CD34+造血干细胞增值的影响,同时观察治疗给药实验中CH辅助化疗的作用.
结果:
1.药效学实验1.1对化疗所致白细胞降低的预防作用:领取清洁级昆明种小鼠,前肢腋下皮下接种肝癌H22细胞,除荷瘤对照组外其余组连续给CTX(30mg/kg)6d造成白细胞低下的模型,在给CTX的同时合用CH(20mg/kg、10mg/kg),每日一次,连用6d.造模过程中隔日计数一次白细胞,停药后每日计数一次白细胞;结果发现停药后24h白细胞计数分别为:荷瘤对照组为(10.93±1.34)×109、CTX组为(1.83±0.31)×109、CH大剂量组为(4.76±0.56)×109、CH小剂量组为(4.03±0.58)×109,CTX组白细胞降至最低.不同浓度的CH组白细胞计数与CTX组相比差异有统计学意(P＜0.05).停药后第6d,给药组白细胞均恢复正常,各组白细胞计数分别为(9.79±1.76)×109、(3.88±0.59)×109、(9.83±1.24)×104、(8.99±1.30)×109,给药组的白细胞计数与CTX组差异有统计学意义(P＜0.05).
1.2对化疗所致白细胞降低的治疗作用:造模方法同预防实验,分为5组,分别是:荷瘤对照组、CTX组、CH大剂量组(20mg/kg)、CH小剂量组(10mg/kg)和G-CSF(50μg/kg),各组于造模后24h开始给药,其中荷瘤对照组和CTX组给生理盐水,以G-CSF为阳性对照组,结果发现G-CSF组白细胞于给药第3d恢复正常,各给药组白细胞计数为:(9.80±1.50)×109、(2.35±0.51)×109、(5.48±0.88)×109、(4.38±0.67)×109、(10.64±2.70)×109,第5d达高峰,依次为(9.48±1.72)×109、(3.98±0.54)×109、(9.49±1.00)×109、(7.28±0.47)×109、(19.48±1.75)×109,从数据可以看出,CH大剂量组白细胞已经恢复正常.各给药组于给药后第6d全部恢复正常,分别为:(9.61±1.46)×109、(4.91±0.63)×109、(10.01±1.30)×109、(9.09±1.42)×109、(17.06±1.35)×109,各给药组与CTX模型组白细胞相比差异有统计学意义(P＜0.05).
2.体外对骨髓CD34+造血干细胞增值的影响取Bab/c小鼠双侧股骨骨髓,分离其有核细胞层,用干细胞培养基稀释至2×105个/ml浓度,在SCF,IL-3,IL-6,LIF存在的条件下,分别与40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml的CH,以G-CSF(50ng/ml)为阳性对照组,在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养5d,观察在不同因素干预下细胞生长情况.于第6d收集细胞,上流式细胞仪检测CD34+细胞表达情况,其结果为:对照组为(49.38±1.12)％、CH大剂量组为(83.67±2.72)％、CH中剂量组为(64.94±3.77)％、CH小剂量组为(53.58±1.72)％、G-CSF组为(61.84±2.51)％,各给药组与阴性对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05),CH大剂量组与G-CSF组相比差异有统计学意义(P＜0.05).
2.体内对骨髓有核细胞数及CD34+造血干细胞增值的影响2.1预防用药对小鼠骨髓有核细胞数及CD34+造血干细胞增值的影响:根据药效学实验,于试验结束后24h处死小鼠,取双侧股骨骨髓,肝素抗凝,计数有核细胞数,结果分别为:荷瘤对照组为(7.79±0.90)×109、CTX组为(1.53±0.30)×109、CH大剂量组为(4.52±0.59)×109、CH小剂量组为(3.63±0.54)×109,用药组与CTX组相比差异有统计学意义(P＜0.05);骨髓液上流式细胞仪检测CD34+细胞表达情况,各组结果为:(4.99±1.38)％、(1.67±0.72)％、(20.63±4.36)％、(11.47±2.59)％.用药组与CTX组相比差异有统计学意义(P＜0.05).
2.2治疗用药对骨髓有核细胞数及CD34+造血干细胞增值的影响:根据药效学实验,于治疗给药后第5d处死动物,处理方法同预防用药.结果:有核细胞计数分别为:对照组为(7.61±1.25)×109、CTX组为(1.59±0.37)×109、CH大剂量组为(4.92±0.68)×109、CH小剂量组为(3.63±0.69)×109、G-CSF组为(7.10±0.66)×109.CD34+造血干细胞阳性率分别为:(5.40±1.22)％、(1.66±0.38)％、(58.66±8.19)％、(37.39±3.95)％、(18.00±4.12)％,用药组与CTX组相比差异有统计学意义(P＜0.05).
2.3治疗用药辅助化疗作用:治疗组处死动物,剖瘤称重,结果为:对照组为(2.11±0.29)g、CTX组为(1.20±0.20)g、CH大剂量组为(0.93±0.14)g、CH小剂量组为(0.79±0.14)g、G-CSF组为(1.10±0.26)g,用CH组与CTX组相比差异有统计学意义(P＜0.05).
结论:
1.CH预防和治疗均可对抗化疗药引起的白细胞降低作用,提示CH具有良好的化疗减副作用.
2.CH在体内和体外均可促进骨髓CD34+造血干细胞的增值,这可能是CH升高白细胞的最重要的机制.
3.CH与化疗药同时应用可使肿瘤减小,提示CH具有良好的辅助化疗效果.
4.本研究为CH的进一步深入研究及临床应用提供了科学的理论依据。