后纵韧带骨化症差异蛋白验证及其功能研究

来源 :第一次全军脊柱外科学术会议暨广东省医学会脊柱外科年会 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jekiyi
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  目的:采用SiRNA技术对体外培养的后纵韧带骨化韧带细胞进行干扰,继续培养的同时设定未干扰的对照组细胞进行对比,以此来确认OGN在后纵韧带骨化中的作用,沉默OGN基因是否能做到阻断骨化过程.以期寻找OPLL发生、发展过程中特异的蛋白标记物,为临床OPLL筛查和诊断、预后判断、寻找治疗药物靶点、了解OPLL发生发展的分子机制提供研究基础.方法:以颈椎前路椎体次全切除术中获得的OPLL后纵韧带组织和外伤患者正常后纵韧带组织做为研究对象.在前期蛋白组学研究得出的正常颈椎后纵韧带与后纵韧带骨化症后纵韧带组织间的差异蛋白的基础上,文献回顾总结各差异蛋白的基本信息、分子功能、细胞分布及其参与的生命过程,推测其在OPLL发病机制中的可能作用.对有深入研究价值的差异表达蛋白质OGN以及Ⅵα1胶原蛋白采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术从mRNA水平进一步验证DIGE及质谱结果准确性.同时利用Western-blot技术在蛋白水平验证其差异.抽取颈椎后纵韧带骨化症患者以及无后纵韧带骨化的患者外周血,利用逆转录技术,以及RT-PCR技术验证编码两种蛋白的mRNA之间的差异.采用SiRNA技术对体外培养的后纵韧带骨化韧带细胞进行干扰,继续培养的同时设定未干扰的对照组细胞进行对比,以此来确认OGN在后纵韧带骨化中的作用.结果:在基因水平验证了正常颈椎后纵韧带组织与后纵韧带骨化症韧带组织中存在差异,编码OGN蛋白的mRNA在颈椎后纵韧带骨化症(cervical ossification of posterior longitudinal ligament,COPLL)韧带组织中是正常颈椎后纵韧带组织中的3.37倍,差异具有统计学意义;编码Ⅵα1胶原蛋白的COL6A1基因在正常颈椎后纵韧带组织中是COPLL韧带组织中的5.31倍,差异具有统计学意义.在蛋白水平正常颈椎后纵韧带组织与后纵韧带骨化症韧带组织中存在差异,OGN蛋白在COPLL韧带组织中是正常颈椎后纵韧带组织中的5.00倍,差异具有统计学意义.Ⅵα1胶原蛋白在正常颈椎后纵韧带组织中是COPLL韧带组织中的5.14,差异具有统计学意义.在外周血中,编码OGN蛋白的mRNA在COPLL患者中高于无后纵韧带骨化患者,COL6A1基因在COPLL患者中低于无后纵韧带骨化患者,但是差异无统计学意义.体外培养颈椎后纵韧带骨化细胞,通过阻断OGN mRNA可以阻断其钙化过程.结论:颈椎后纵韧带骨化症患者的后纵韧带组织中,无论是基因水平还是蛋白水平OGN都明显高于正常颈椎后纵韧带组织,而Ⅵα1胶原蛋白都明显低于正常颈椎后纵韧带组织.颈椎后纵韧带骨化症患者外周血中,编码OGN蛋白的mRNA和COL6A1基因无法作为后纵韧带骨化症早期诊断的血液标志物.OGN在颈椎后纵韧带骨化过程中起着重要作用.通过阻断OGN mRNA可以阻断其钙化过程从而阻断骨化过程,可以作为生物治疗颈椎后纵韧带骨化症的目标基因进一步研究开发.
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