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一、研究目的韧带严重损伤后不能自愈,临床上有多种替代物应用于韧带的修复重建。替代物主要包括自体、异体韧带／肌腱移植物和人工合成材料,但均因各自固有的缺陷而不能取得满意的疗效。理想的韧带替代物必须具备良好的力学特性,组织相容性,并且在机体内降解吸收的过程中形成与韧带相一致的生物活性组织,从而达到生理性修复创伤和重建功能目的。组织工程韧带(TEL)具备以上优点,是一种理想的韧带替代物。TEL由种子细胞和具有韧带性能的支架构成,韧带支架必须具备良好的细胞相容性、生物力学特性并且免疫原性小。韧带脱细胞支架能保留韧带固有的三维结构、良好的生物力学特性和细胞相容性等优点,而且韧带细胞外基质(ECM)主要由ⅠⅢ型胶原蛋白组成,其自身的免疫原性低。因此,韧带脱细胞支架有望成为理想的组织工程韧带支架。脱细胞是韧带脱细胞支架制备的主要步骤,现有的多种韧带脱细胞方法对韧带ECM均有不同程度的影响。本研究通过比较1%脱氧胆酸钠(DCA)法、1%磷酸三丁酯(TBP)法和点阵激光处理髌韧带腱膜后脱细胞法,对兔髌韧带的去细胞效果、支架的组织结构、测定脱细胞支架的胶原含量和生物力学性能进行比较。同时将韧带脱细胞支架体外与同种异体韧带细胞复合培养,以及将脱细胞支架植入同种异体内,观察组织细胞的生物相容性。二、研究方法(一)脱细胞方法取新西兰大白兔髌韧带分三组:分别用DCA法、TBP法和腱膜点阵激光处理法进行脱细胞。DCA法：10mM tris 36h+0.01%胰蛋白酶+0.02%EDTA 8h+1% DCA24h+核酸酶(DNaseⅠ200μg／ml+RNaseⅠ200μg／ml)5h+PBS 48h；TBP法：10mMtris 36h (0.02% EDTA 8h)+1%TBP 48h+核酸酶(DNaseⅠ200μg／ml+ RNaseⅠ200μg／ml)5h+PBS冲洗48h；腱膜点阵激光处理法：髌韧带腱膜用激光处理(10%击孔密度和5mJ能量)+10mM tris 36h(0.02％EDTA8h)+PBS72h。所有操作在室温、摇床(150RPM)进行,均加5ml／L青霉素／链霉素溶液(10000U／ml10000mg／ml)溶液预防感染,完成每一步骤均使用PBS冲洗3遍。(二)组织学、胶原含量和生物力学检测通过组织学切片HE染色、Masson染色、DAPI染色、免疫组织化学观察脱细胞效果。使用组织DNA提取试剂盒进行DNA定量,检测脱细胞前后支架内DNA含量变化。使用羟脯氨酸试剂盒进行测试分析羟脯氨酸的含量,根据羟脯氨酸占胶原蛋白总量的13.4%的比例,计算胶原蛋白的含量,观察脱细胞对支架胶原蛋白的影响。检测样本最大张力负荷和弹性模量,观察脱细胞对韧带生物力学的影响。(三)脱细胞支架内部种子细胞的种植冻干(低压冻干法yophilization)脱细胞支架(DCA法)经γ射线灭菌后与3代同种异体韧带成纤维细胞在体外复合培养,成纤维细胞通过细胞悬液渗透入支架内部种植于脱细胞支架上,将分别在3天和1周取组织切片HE染色观察细胞在韧带表面和支架内部生长情况。观察韧带脱细胞支架体外细胞相容性。(四)同种异体体内组织相容性将韧带脱细胞支架(DCA法)植入同种异体(兔)体内,术后3周取出,组织切片HE染色,观察脱细胞韧带周围及其内部炎症细胞和成纤维细胞的浸润情况。三、结果(一)组织学、胶原含量和生物力学检测结果组织学显示三种脱细胞方法均能彻底脱除细胞成分,HE染色未见细胞核成分残留,胶原纤维形态无明显破坏；DCA法处理的脱细胞支架组织切片DAPI荧光显色未见阳性结果,提示DNA成分脱除彻底；细胞波形蛋白Vimentin免疫组化染色显示阴性,提示细胞浆内蛋白脱除彻底。相同干重的正常韧带和韧带脱细胞支架(DCA法)DNA定量比值约4.7：1,各组胶原蛋白含量测定与新鲜韧带比较无明显差异。与脱细胞前髌韧带比较,生物力学检测示DCA法和TBP法获得脱细胞髌韧带支架最大拉力载荷和弹性模量比较有统计学差异,而腱膜点阵激光处理法获得的脱细胞韧带生物力学差异不明显。(二)脱细胞韧带体外细胞种植方法的初步评价脱细胞支架与同种异体韧带成纤维细胞静止复合培养3天和7天后,组织切片HE染色显示：韧带脱细胞支架表面粘附有单层成纤维细胞,成纤维细胞通过静止渗透法能植入冻干韧带脱细胞支架内部,见成纤维细胞沿胶原纤维生长良好。(三)同种异体体内组织相容性观察结果术后3周取组织切片HE染色观察,见韧带脱细胞支架周围有少量单核细胞、淋巴细浸润,无炎性肉芽组织生成。与韧带原位缺损修复比较,周围炎症细胞浸润无增多表现。脱细胞支架边缘可见较多的成纤维细胞浸润,脱细胞韧带腱膜能有效阻止宿主细胞侵入支架内部,腱膜不完整处可见较多量成纤维细胞迁移人脱细胞支架内部。四、结论(一)DCA法、TBP法和腱膜点阵激光处理法均能有效脱除韧带内部细胞成分,并对韧带胶原成分和生物力学有一定程度影响。(二)成纤维细胞通过渗透法能植入冻干韧带脱细胞支架内部,见成纤维细胞沿胶原纤维生长良好。(三)韧带脱细胞支架植入同种异体内排斥反应和炎症反应小,组织相容性好。脱细胞韧带腱膜能有效阻止宿主细胞向支架内部迁移,腱膜不完整处可见较多量成纤维细胞迁移入脱细胞支架内部。