【摘 要】
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[目的]以具有产kappa-卡拉胶酶能力的菌株Zobellia sp.M2为试验菌株,设计引物获取kappa-卡拉胶酶全基因,构建表达载体HTA-KC及HTA-KC-SIG,在大肠杆菌BL21 (DE3) plysS诱
【机 构】
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中国海洋大学食品科学与工程学院,山东 青岛,266003
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[目的]以具有产kappa-卡拉胶酶能力的菌株Zobellia sp.M2为试验菌株,设计引物获取kappa-卡拉胶酶全基因,构建表达载体HTA-KC及HTA-KC-SIG,在大肠杆菌BL21 (DE3) plysS诱导表达可溶性蛋白.分析信号肽与重组酶胞外分泌能力的关系,并进行重组酶分离纯化及其酶学性质的研究.[方法]扩增Zobellia sp.M2的16S rRNA序列,应用MEGA 4.0进行进化树分析,并结合NCBI所收录kappa-卡拉胶酶基因序列所属菌株与Zobellia sp.M2的亲缘关系选择引物设计模板,应用Primer-Blast设计引物扩增包含有kappa-卡拉胶酶基因序列片段,对序列进行分析.设计带有限制酶切位点BamH1、XhoI的引物扩增全基因,构建克隆载体pUCm-KC和pUCm-KC-SIG,确认序列无误后构建表达载体HTA-KC及HTA-KC-SIG,分别转入BL21 (DE3) plysS IPTG诱导表达,DNS法检测胞外酶活的同时采用Ni-亲和层析法分离纯化带有his-tag标签的重组蛋白,SDS-PAGE进行鉴定.[结果]得到一种新的kappa-卡拉胶酶基因,与现有序列最大相似度为86％.克隆载体确认序列后构建表达载体HTA-KC及HTA-KC-SIG,并成功诱导表达.DNS法测胞外酶活,结合SDS-PAGE结果显示,原卡拉胶酶基因信号肽在重组菌种发挥明显作用,重组蛋白以可溶并具有活性形式表达.该实验为进一步解析重组酶酶学性质,提高重组酶的产量以及实现酶的大量生产等研究奠定了基础.
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