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目的:机械牵张气道上皮细胞可导致miR-19b表达特异性升高,以miR-19b为切入点,研究该miRNA在ALI/ARDS发生发展中对气道上皮细胞的上皮间质转分化(EMT)的影响及其机制.
方法:机械牵张小气道上皮细胞,实时定量荧光PCR检测miR-19b的表达,免疫印迹检测EMT指标的表达以确保建立机械牵张诱导的EMT模型.沉默及过表达miR-19b,免疫印迹检测EMT标志物,其中上皮标志物包括CK8,E-cadherin,SP-B,间质标志物包括Vimentin,N-eadherin,a-SMA,以证实miR-19b在机械牵张诱导的EMT中的作用.通过miRNA靶基因预测软件,预测PTEN是miR-19b的靶基因.沉默和过表达miR-19b,免疫印迹检测PTEN表达,以证实PTEN和miR-19b的靶对关系(为更直接说明miR-19b和PTEN的靶对关系,正开展双荧光素酶报告基因试验).为进一步证实靶基因的功能,转染高表达PTEN质粒至小气道上皮细胞,机械牵张48小时后免疫印迹检测EMT标志物.
结果:机械牵张小气道上皮细胞可以上调miR-19b的表达并促进EMT，即上皮标志物CK8E-cadherin. SP-B表达上调，间质标志物Vimentin, N-cadherin，a-SMA表达下调。沉默miR-19b可部分逆转机械牵张诱导的EMT，而过表达miR-196则可直接促进EMT，证实了miR-19b是参与EMT的重要分子。沉默miR-19b可致预测的靶基因PTEN上调，反之，过表达miR-19b可致PTEN下调，间接说明了miR-19b和PTEN之间的靶对关系。高表达PTEN可部分逆转机械牵张诱导的EMT。
结论:机械牵张小气道上皮细胞可以上调miR-19b的表达并促进上皮间质转分化;miR-l9b可通过靶向PTEN参与上皮间质转分化。