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酶工程是生物工程的主要分支之一.如何快速准确地进行酶的优化筛选一直以来是酶工程领域的重要研究方向.早期的优化筛选方法由于方法学的局限主要集中于点突变,平板筛选等低通量模式.然而由于酶的活性功能通常是由多个氨基酸协同作用决定,低通量筛选模式无法适应超大突变株文库筛选的要求.随着流式细胞仪和高通量测序仪的出现,以及高效荧光抗体标记的发展,新一代高通量优化筛选方法的建立成为了可能.有效地结合了荧光标记，流式细胞仪，酵母表面展示和高通量测序等多种技术手段，建立了一种新的酶高通量优化筛选平台，称之为酵母内质网滞留系统，简称为YESS。本文运用YESS对一种具有重要科研与工业用途蛋白酶（烟草蚀纹病毒蛋白酶）进行了优化改造。首先通过针对底物结合中心的定点突变文库（>107）的筛选，成功改变了烟草蚀纹病毒蛋白酶的底物特异性，得到了可识别不同底物的烟草蚀纹病毒蛋白酶突变株。随后基于所得到的蛋白酶突变株，建立了随机突变文库（>108）来进一步筛选具有高催化活性的蛋白酶突变株。通过多次筛选成功分离了针对新的特异性底物的高活性烟草蚀纹病毒蛋白酶突变株。动力学分析表明，得到的突变株在底物选择性相对于原野生菌株上有5000倍的变化，同时相对于市面产品具有约2倍高的底物催化活性。此外，基于酵母的真核细胞特性，YESS已被初步证明能广泛运用于病毒至人体的蛋白酶，分选酶和激酶的优化筛选。同时，通过与高通量测序技术的结合，运用生物信息学手段初步揭示了酵母体内存在于高尔基体和内质网的蛋白酶介导的蛋白翻译后修饰。这一研究内容将对酵母工程菌的改造以及高尔基体和内质网介导的疾病研究有重要指导作用。