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目的: 目前生产维生素C(Vitamin c，Vc)的主要方法为我国上世纪70年代首创的Vc二步发酵法。两步发酵法需通过两次发酵及三种微生物的共同作用，存在发酵工艺复杂和微生物代谢污染等问题，目前Vc生产工艺发展的主流方向是将两步发酵简化为一步单菌发酵。本实验室在前期工作中，通过在负责醇糖转化的氧化葡糖杆菌中导入产酸基因簇实现了由D-山梨醇到2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KGA)的一步单菌发酵，但醇酸转化率较低。本课题对山梨醇相关基因及代谢途径进行了研究，尝试通过增强主路代谢和阻断旁路代谢两方面来提高一步菌醇酸转化率。 方法: (1)选取了四种常用和一种文献报道的氧化葡糖杆菌强启动子，同时通过氧化葡糖杆菌转录组测序选取了转录水平最高的三种启动子，构建山梨糖脱氢酶山梨酮脱氢酶表达载体，电击转化氧化葡糖杆菌比较2-KGA产量。 (2)根据基因组注释和转录组差异分析并结合文献调研预测了12种可能参与山梨醇代谢的基因，包括3种山梨醇脱氢酶(SLDH)、3种山梨糖还原酶(SR)、3种木糖醇脱氢酶(XDH)和3种酮古龙酸还原酶(HADH)，通过课题组建立的快速高效同源重组法对这些酶的编码基因进行一敲除，分别以山梨醇、山梨糖为碳源对敲除菌进行生长及糖酸代谢水平评价。选择表型变化大的敲除菌进行基因回补。部分敲除菌导入山梨糖脱氢酶山梨酮脱氢酶表达载体，比较基因敲除前后菌株醇糖代谢及2-KGA产量的变化。同时，为建立基因无痕敲除操作系统以实现多个相关基因的敲除，对upp基因进行敲除及回补工作，通过Tn5转座突变筛选其他未知的与旁路代谢相关基因。 结果: (1)在试管及摇瓶中培养，PcsbD启动子与天然启动子相比产酸量分别提高15％和19％。 (2)目前已分别在氧化葡糖杆菌H24和1.637中成功敲除了10个和11个基因。分别以山梨醇、山梨糖为碳源对敲除菌进行评价发现，敲除菌H24Δsr3以山梨糖为碳源时前期生长缓慢，而敲除菌1.637Δsr3在两种碳源中前期生长缓慢;H24和1.637的sr1、sr2、sr3敲除菌以山梨醇为碳源时山梨糖的积累增多，其中1.637Δsr3敲除菌山梨糖积累最多，1.637Δsr3的回补实验结果进一步证明sr3基因影响菌体生长及山梨糖利用。导入山梨糖脱氢酶山梨酮脱氢酶表达载体后，1.637Δsr3产酸量高于野生菌1.637。 (3)完成了氧化葡糖杆菌upp基因敲除及回补，构建pBBR1MCS5-sndhsdh/1.637重组菌株Tn5突变体库，筛选出20株疑似产酸增强突变株。 结论: (1)筛选得到1个产酸水平高于天然启动子的启动子PcsbD，能够提高醇酸转化率，增强主路代谢。 (2)通过对敲除菌评价分析发现在氧化葡糖杆菌基因组中sr3基因与菌体生长及山梨糖利用相关。 (3)构建了氧化葡糖杆菌upp基因敲除菌，回补实验证明upp能够作为负筛选标记基因。