【摘 要】
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胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的呼吸道病原细菌，其中Apx毒素和尿素酶(Urease)均是其主要的毒力因子，且Apx毒素又是其主要的免疫原性蛋白.为构建APP减毒突变菌株，本试验首先利用仅表达ApxⅡ毒素的APP血清7型参考菌株(WF83)，缺失apxⅡC基因片段并插入具有免疫原性的apxⅠA-N基因片段，利用sacB基因负向筛选系统构建无抗生素抗性基因标记的apxⅡC-/apx
【机 构】
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北京市农林科学院畜牧兽医研究所,畜禽疫病防控技术北京市重点实验室,北京,100097
【出 处】
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2016第六届中国兽药大会(中国畜牧兽医学会动物药品学分会第五届全国会员代表大会暨2016学术年会、中国微生物学会兽医微
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胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的呼吸道病原细菌，其中Apx毒素和尿素酶(Urease)均是其主要的毒力因子，且Apx毒素又是其主要的免疫原性蛋白.为构建APP减毒突变菌株，本试验首先利用仅表达ApxⅡ毒素的APP血清7型参考菌株(WF83)，缺失apxⅡC基因片段并插入具有免疫原性的apxⅠA-N基因片段，利用sacB基因负向筛选系统构建无抗生素抗性基因标记的apxⅡC-/apxⅠA+单突变菌株(GS7C)；在单突变菌株GS7C构建成功的基础上进一步缺失基因组中ureC基因片段，并插入具有免疫原性的apxⅢ-N基因片段，进而再利用sacB基因负向筛选系统构建成功表达ApxⅢ-N蛋白的apxⅡC-/apxⅠA+、ureC-/apxⅢ+双突变菌株(GS7CA).该双突变菌株生物学特性鉴定结果显示，双基因突变不影响细菌增殖能力；溶血活性和尿素酶活性完全丧失；Western blot鉴定结果显示可表达ApxⅡ蛋白及插入的外源基因ApxⅢ-N蛋白，但未表达插入的ApxⅠA-N蛋白；连续传代基因组中插入的外源基因apxⅠA-N和apxⅢ-N基因片段均可稳定遗传；母源菌株APP7和突变菌株(GS7C和GS7CA)对小鼠攻毒试验结果显示，突变菌株GS7C和GS7CA对小鼠毒力的LD50值较母源菌株APP7分别增加5.2倍和9.2倍，提示单突变和双突变菌株对小鼠的毒力较母源菌株均显著降低；对断奶仔猪攻毒试验显示双突变菌株GS7CA对仔猪肺脏的损伤指数较母源菌株显著降低；利用双突变菌株GS7CA作为弱毒活疫苗对仔猪进行鼻腔接种免疫，免疫两次后利用APP血清1、2、7型参考菌株进行攻毒，攻毒后通过每组死亡数和肺损伤指数的差异进行比较结果显示，免疫组在仔猪死亡数、临床症状、肺损伤指数等方面较非免疫对照组均显著降低，提示GS7CA作为弱毒活疫苗具有一定的攻毒保护效果.本试验结果提示构建的APP双突变菌株具有发展成为APP减毒活疫苗的潜力，为研制具有交叉保护活性的APP基因工程减毒活疫苗奠定了基础.
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