论文部分内容阅读
大豆蛋白以其资源充足、氨基酸组成较理想而成为畜禽饲料中主要的植物性蛋白质来源.但大豆蛋白中所含的致敏原成分,会引起幼龄畜禽肠道过敏反应,导致肠黏膜损伤,养分消化吸收减少,生长受阻,从而限制了其在幼龄动物饲料中的应用.目前人们主要通过膨化加工、微生物发酵等方法来消减大豆蛋白中的致敏原活性,而高效灵敏的致敏原检测技术的开发将极大促进无/低致敏性大豆蛋白产品加工技术的发展.本文旨在研制能特异性识别大豆蛋白中过敏性抗原表位的单克隆抗体,以便下一步研究建立特异性强、敏感性高的ELISA检测技术.采用猪IgE ELISA试剂盒遴选大豆蛋白过敏阳性仔猪血清,并以其作为一抗采用Western blot技术分析大豆蛋白各组分的致敏性.根据β-伴大豆球蛋白α亚基氨基酸序列,设计并合成含8 ～ 20个氨基酸的短肽7条,采用间接ELISA方法以阳性血清为一抗、抗猪IgG/IgE抗体为二抗,分析各短肽的致敏性强弱.选择致敏性最强的短肽为抗原,与载体蛋白KLH(钥孔血蓝蛋白)以1∶1偶联后免疫8周龄雌性BALB/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以间接ELISA和Western blot技术筛选阳性杂交瘤细胞,阳性细胞进一步采用有限稀释法进行2次亚克隆筛选(间接ELISA和Western blot法)分泌抗β-伴大豆球蛋白单克隆抗体的细胞株.选择效果最好的一株细胞扩大培养,选取10周龄雌性BALB/C小鼠腹腔注射液体石蜡1周后以3×106个细胞/小鼠腹腔注射上述细胞,1周后收集腹水,用Protein G亲和层析柱纯化抗体.结果表明,(1)β-伴大豆球蛋白α、α、β3个亚基均可与阳性血清反应,是大豆蛋白的主要致敏原组分,可引起IgE介导的过敏反应,与文献报道一致.(2)合成的7条短肽均能与阳性血清中的IgG产生特异性反应,其中肽7的OD值最高(即血清中相应的特异性抗体含量最高)；4条短肽能与阳性血清中IgE产生特异性反应,同样肽7的OD值最高(即血清中相应的特异性抗体含量最高),提示本试验所合成的7条短肽中,肽7的致敏性最强.(3)免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的融合率为100％,经有限稀释法2次亚克隆筛选获得分泌抗β-伴大豆球蛋白单克隆抗体的细胞株28株.选择效果最好的一株细胞腹腔注射BALB/C小鼠制备的腹水及纯化单克隆抗体Western blot分析表明能特异地与β-伴大豆球蛋白α亚基反应；间接ELISA测定表明腹水效价为1∶32 000,纯化抗体稀释至0.25 μg/ml时ELISA检测结果仍呈阳性；非竞争性ELISA法测定结果表明该单克隆抗体亲和常数为5.22×108L/mol；亚类鉴定结果表明该单克隆抗体为IgG1型,轻链为κ链.本研究在分析合成短肽抗原过敏性强度的基础上成功制备了β-伴大豆球蛋白单克隆抗体,为今后建立高效灵敏的大豆蛋白致敏原检测分析技术奠定了基础.