【摘 要】
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目的：分别建立诱导上调和下调真核翻译起始子eIF3g表达的细胞系,以进一步研究eIF3g对肿瘤细胞的作用及机制.方法：利用RT-PCR法克隆eIF3g全长编码区序列,测序验证后连接到四
【机 构】
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浙江大学医学院附属第二医院临床研究中心,杭州,中国
【出 处】
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2012年全国肿瘤分子标志学术大会与国际肿瘤转化医学论坛暨第七届中国中青年肿瘤专家论坛
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目的：分别建立诱导上调和下调真核翻译起始子eIF3g表达的细胞系,以进一步研究eIF3g对肿瘤细胞的作用及机制.方法：利用RT-PCR法克隆eIF3g全长编码区序列,测序验证后连接到四环素调控的慢病毒诱导表达系统中的载体pLVX-Tight-Puro上,构建可诱导外源性eIF3g过表达载体；通过设计针对人eIF3g的人工microRNA前体序列,利用两次PCR扩增获得目的片段,经测序验证后以三个重复人工microRNA前体串联方式连接到pLVX-Tight-Puro上,构建可诱导抑制eIF3g表达的人工microRNA表达载体.包装慢病毒后,分别感染乳腺癌Bcap37细胞,用400g/ml G418和0.4 g/mlPuro共同筛选感染后的细胞,分别获得稳定转染可诱导eIF3g过表达和抑制表达的乳癌细胞克隆.将获得的单克隆细胞分别在1 9/ml DOX的作用下诱导培养72h,用Western Blot检测eIF3g的表达,鉴定所得到的细胞克隆的诱导表达作用.结果：DNA测序结果表明,克隆的eIF3g全长编码区序列和针对人eIF3g的人工microRNA前体序列与预期相符.酶切鉴定表明各载体构建正确.Western Blot检测结果显示,Dox可以明显上调稳定转染诱导型eIF3g过表达载体的Bcap37细胞中eIF3g的表达,也可明显下调稳定转染诱导型针对eIF3g的人工microRNA表达载体的Bcap37细胞中eIF3g的表达.结论：成功建立了可诱导上调和下调eIF3g表达的乳腺癌Bcap37细胞系,为以此两种细胞为模型进一步研究eIF3g对肿瘤细胞的作用和机制打下了基础.
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