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目的：利用内皮祖细胞作为vegf165和bfgf基因的载体,同时发挥干细胞及VEGF的促血管新生作用来改善缺血肢体的血供.
方法：1.穿刺新西兰兔骼峭抽取骨髓,FICOLL梯度离心分离骨髓单个核细胞.EPC诱导分化增殖培养,2.MTT法测定骨髓EPCs增殖曲线3.对培养好的EPCs进行CD133、vWF因子、CD34及CD31的鉴定4.对EPCs进行不同滴度病毒感染,并对其进行流式细胞学检测、MTT检测.5.对不同滴度感染后EPCs上清液用ELISA法进行蛋白定量检测.6.用成管实验检测已确定的最佳感染滴度感染的EPCs分泌的上清液所促HUVECs成管能力7.对实验动物分组:实验用新西兰兔40只,随机分为10组,包括:进行阴性对照的无处理组,注射EPC组,注射Adv-gfp-vegf165感染EPC组,注射Adv-gfp-bfgf感染EPC组及注射联合Adv-gfp-vegf165与Adv-gfp-bfgf感染EPC组(n=4).以上各组又分为7d,14d组.8.对实验动物进行下肢缺血模型的建立,并用超声多普勒测流速测定下肢血流回复情况.9.对下肢肌肉进行CD31、SMA染色,观察血管新生情况.并对肌肉进行VEGF、bFGF ELISA蛋白定量检测.
结果：1.内皮祖细胞分离培养与鉴定及生物学特性分析内皮祖细胞于培养3-4d完全贴壁,呈克隆样生长,7-9d形成类似成熟血管内皮细胞形态,细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为95％.获得的第2代细胞生长曲线近似"s"形、MTT法显示3-5d细胞增殖较明显,第2代EPC进行免疫荧光鉴定结果显示:内皮祖细胞阳性表达CD34、CD133、vWF因子,CD31弱阳性表达.2.vegf165基因与bfgf基因感染内皮祖细胞的试验研究各组细胞均在镜下见几乎所有细胞呈绿色荧光,流式细胞学检测结果可见随着病毒滴度的上升,感染率也上升.但当病毒滴度大于1∶300时,可明显见到搜集细胞总数下降.相对单基因感染EPC,联合基因感染EPC当两种病毒总滴度为1∶200时,未见明显搜集细胞总数下降,而感染率则明显上升.MTT法,感染病毒后,各组细胞均随病毒滴度上升而增值状态不同程度下降.ELISA实验可知,随着病毒滴度在一定范围内升高,VEGF与bFGF在细胞上清液内分泌量也随之升高.但当病毒滴度超过1∶300时,分泌量骤然下降.成管实验可见在VEGF及bFGF因子的促进下,HUVECs在Metrigal中可以形成管状结构.与各处理组与阴性对照组有显著差异.而基因改造的EPC分泌出的VEGF和bFGF与重组纯的VEGF、bFGF因子无显著差异.而联合感染组上清对单因子组有统计学差异3.联合vegf165基因与bfgf基因感染内皮祖细胞对肢体缺血性疾病的治疗作用及机制研究于第7、第14天对处理后的兔子行超声多普勒血流流速检测,7天时联合感染EPC移植组统计优于单基因感染EPC组.14天时,移植各组仍优于未移植组.CD31及SMA染色可见联合感染组阳性率高于其他各组.肌肉VEGF与bFGF蛋白ELISA测定,发现在3d时,细胞移植组均比控制组肌肉中VEGF表达量高,且感染有vegf165基因的EPC组均对未感染组有显著优势,感染组肌肉内表达VEGF量在14d比7d可见明显减少.在3d时,细胞移植组均比控制组肌肉中bFGF表达量高,且感染有bfgf基因的EPC组均对未感染组有显著优势,感染组肌肉内表达bFGF量在14d比7d可见明显减少.
结论：1.本实验从兔骨髓中分离培养了EPC,其生长形态、细胞的表面标记及显微结构符合EPC的特点,说明骨髓是EPC的重要来源之一.2.本实验用不同滴度的腺病毒感染EPC,用流式细胞学、MTT以及ELISA蛋白定量证明1∶200是最佳的感染滴度.3.用成管实验确定基因改造后的EPC分泌的.