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目的:为研究LDL受体基因新突变体的功能及其致病机制,本研究收集4例FH先证者及其核心家系,通过DNA测序检测其突变基因,并在核心家系中验证.构建LDLR突变体,并进行细胞转染,利用激光共聚焦显微镜观察突变体亚细胞定位及内吞能力,利用流式细胞术检测细胞表面突变体表达量及内吞功能,最终确定其致病性,并初步阐明其致病机制.
方法:1.根据FH的诊断标准,对4例FH先证者进行病史询问及体格检查;2.对4例FH先证者进行生化检测及心脏/大血管超声检查;3.抽取患者其及家系成员空腹外周静脉血,提取基因组DNA (gDNA);4.通过PCR对LDLR、apoB及PCSK9的编码区域进行扩增,扩增产物经纯化后进行测序;5.测得的突变位点对应片段在其双亲中进行测序验证;6.以野生型LDLR质粒为模板,用QuickChange XL定点诱变试剂盒对突变基因进行诱变,构建LDLR基因突变体;7.纯化LDLR基因突变体,并测序验证;8.将野生型及突变质粒转染HER-293细胞,并培养;9.用激光共聚焦显微镜(CLSM)鉴定转染细胞中的LDLR蛋白的亚细胞定位及其内化LDL的能力;10.用流式细胞术检测细胞表面LDLR表达量及其内吞LDL活性.
结果:1.收入的4例FH先证者均符合临床FH诊断标准,皮肤及肌腱多发黄色瘤;2.先证者血浆胆固醇水平大幅增高(11.98～16.87mmol/L),颈动脉内膜中层不同程度增厚并伴发斑块;3.成功提取先证者gDNA,纯度及浓度均符合要求;4.先证者均无apoB及PCSK9基因突变,而存在LDLR杂合错义突变,分别为C201F、G615V、Y398X及G186C;5.先证者家系中检测出相同基因突变,先证者的基因突变来自于其父母;6.成功诱变LDLR基因突变体;7.所构建的LDLR基因突变体为目的质粒;8.成功将质粒转染入HEK-293细胞,转染效率为55％～60％;9.突变体LDLR蛋白均部分潴留于内质网,且仍保留一定内化LDL能力,属于2B型突变;10.突变体细胞表面LDLR表达量及其内吞LDL活性均明显下降,LDL受体功能受损.
结论:1.收集的4例先证者均符合FH临床诊断标准,其中2号先证者为纯合子,其余3例先证者均为杂合子;2.先证者存在LDLR基因4种突变,且均为新突变,并分别来自于父母;3.成功构建4种LDLR突变体;4.突变体均部分潴留于内质网,不能有效转运至细胞表面发挥作用,属于2B型突变;5.突变体细胞表面受体表达量及内吞LDL活性均明显降低,为致病性突变.