【摘 要】
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目的：制作帕金森病(Parkinsons disease,PD)细胞和动物模型,给予人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from human umbilicalcord,hUC-MSC)和姜黄素诱导的hUC-MSC处理后,观察并比较两种细胞对PD的治疗作用,并探讨其相关的机制.方法：采用组织块法分离培养hUC-MSC,运用流式细胞仪检测多种分子表面标志
【机 构】
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中国人民解放军第148中心医院神经内科
【出 处】
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中国医师协会神经修复学专业委员会第四届年会暨国际高峰论坛
论文部分内容阅读
目的：制作帕金森病(Parkinsons disease,PD)细胞和动物模型,给予人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from human umbilicalcord,hUC-MSC)和姜黄素诱导的hUC-MSC处理后,观察并比较两种细胞对PD的治疗作用,并探讨其相关的机制.
方法：采用组织块法分离培养hUC-MSC,运用流式细胞仪检测多种分子表面标志,以确定分离培养出来的细胞符合hUC-MSC细胞免疫表型,同时对hUC-MSC进行相关质控工作.制作姜黄素活化hUC-MSC的浓缩条件培养液(ConditionMedium-curcumin,CM-CUR),hUC-MSC细胞上清浓缩成相同浓度的条件培养液CM-MSC;MPP+作用于SH-SY5Y细胞制成PD细胞模型,加入同浓度的CM-CUR和CM-MSC,CCK-8法和结晶紫染色检测PD模型细胞的增殖;免疫荧光检测细胞内酪氨酸羧化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和特异性蛋白微管结合蛋白(Microtubule-associated protein2,MAP2)的表达.将MPTP和丙磺舒腹腔注射C57小鼠制作PD动物模型,尾静脉注射hUC-MSC和姜黄素活化的hUC-MSC,每周一次,107个/kg,持续治疗8周,治疗结束后再观察八周,自主活动计数实验和转棒法检测各组小鼠行为学的变化;免疫组化和Western blot检测小鼠纹状体区TH的表达;高效液相色谱法检测小鼠纹状体区DA含量的变化;Westernblot检测小鼠纹状体区还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸-黄递酶(nicotinamideadenine dinuleotide phosphate diaphorase,NADPH-d)的表达,以估测一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)的表达水平;RT-PCR检测凋亡因子Bcl-2和Caspase-3的表达.将姜黄素刺激活化的hUC-MSC制作超薄切片,透射电镜下观察细胞超微结构的变化;ELISA检测姜黄素刺激活化的hUC-MSC细胞上清中多种细胞因子和生长因子的变化.
结果：采用组织块法可方便经济的从脐带中成功分离出间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表达间充质干细胞分子表面标志CD29,CD44和CD105,而不表达内皮细胞标志CD31、造血细胞表面抗原CD45和人白细胞抗原-DR(HLA-DR);分离培养的hUC-MSC没有细菌、真菌、乙肝病毒、HIV病毒和内毒素的污染,可用于接下来的实验;根据CCK-8的结果,选取5μmol/L作为刺激hUC-MSC的姜黄素的实验浓度;应用MPP+成功诱导SH-SY5Y细胞出现凋亡,制作PD细胞模型,加入CM-CUR和CM-MSC后,可促进凋亡的SH-SY5Y细胞出现增殖、分化,并促进TH和MAP2的表达.PD小鼠注射细胞后,无论从行为学、TH和DA的含量、NOS的表达还是凋亡因子的变化,结果均表明姜黄素刺激活化的hUC-MSC比单纯的hUC-MSC治疗PD的效果明显.透射电镜下观察可发现：姜黄素刺激活化的hUC-MSC比单纯的hUC-MSC细胞内粗面内质网和蛋白体增多;ELISA结果表明：同单纯的hUC-MSC相比,姜黄素刺激活化的hUC-MSC上清中IL-10、HGF、NGF和VEGF的表达上调.所有的实验数据使用SPSS10.0统计软件,两组间比较采用T检验,多个样本均数比较采用单因素方差分析.
结论：①在PD细胞模型中,姜黄素诱导的hUC-MSC细胞上清可促进已出现凋亡的细胞再次增殖,并向DA能神经元分化;②在PD动物模型中,行为学测试、免疫组化和Western blot结果表明姜黄素诱导的hUC-MSC比不做任何处理的hUC-MSC治疗PD的效果好,主要原因是姜黄素诱导的hUC-MSC可更好的抵抗PD小鼠脑内的氧化应激反应,并能有效的保护纹状体区DA能神经元,防止其凋亡变性;③为了探讨出现上述情况的机制,对姜黄素诱导的hUC-MSC细胞进行研究,结果提示姜黄素可使hUC-MSC分泌功能变强,上清中多种有利于PD修复的细胞因子如IL-10、HGF、NGF和VEGF的表达上调.
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