【摘 要】
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通过分析茶树咖啡碱合成途径中的N-甲基转移酶基因TCS1与ICS1、PCS1的蛋白质空间结构模型,找到了四个可能影响TCS1催化活性的关键位点进行定点突变,构建突变基因重组原核表达
【机 构】
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安徽农业大学教育部茶叶生物化学与生物技术重点实验室,合肥 230036
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通过分析茶树咖啡碱合成途径中的N-甲基转移酶基因TCS1与ICS1、PCS1的蛋白质空间结构模型,找到了四个可能影响TCS1催化活性的关键位点进行定点突变,构建突变基因重组原核表达质粒pMAL-TMx并在表达菌株BL21(DE3)pLysS中高效表达.茶树咖啡碱合成酶TCS1的四个突变体分别是TM1:225位精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His);TM2:317位缬氨酸(Val)突变为甲硫氨酸(Met);TM3:271位苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp);TM4:272位丙氨酸(Ala)突变为脯氨酸(Pro).基因TCS1 突变后,对表达的融合蛋白进行活性分析,突变体TMx 酶催化活性发生较大变化,其中TM1只具备3-N位甲基化活性,即只能催化7-MX合成可可碱;突变体TM2,TM3,TM4均能催化7-MX合成可可碱和咖啡碱,但催化能力有明显差异.
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