【摘 要】
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[目的]筛选和鉴定喹赛多促生长作用的靶蛋白,分析靶蛋白的功能,并研究与靶蛋白相关基因的表达变化,以阐明喹赛多可能的促生长作用机制.[方法]在保留喹赛多母环结构的基础上,将其改造成为喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧,利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)方法检测L-02细胞中EGF mRNA的表达水平,以验证结构改造物的生物活性.将喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧与富含氨基的树脂基质Toyopear
【机 构】
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国家兽药残留基准实验室(HZAU)/农业部兽药残留检测重点开放实验室,华中农业大学 中国武汉430070
【出 处】
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中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨
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[目的]筛选和鉴定喹赛多促生长作用的靶蛋白,分析靶蛋白的功能,并研究与靶蛋白相关基因的表达变化,以阐明喹赛多可能的促生长作用机制.[方法]在保留喹赛多母环结构的基础上,将其改造成为喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧,利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)方法检测L-02细胞中EGF mRNA的表达水平,以验证结构改造物的生物活性.将喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧与富含氨基的树脂基质Toyopearl AF-Amino-650M偶联,并利用高效液相色谱(HPLC)检测偶联效率.将固定化配体喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质与L-02细胞各亚细胞组分蛋白裂解液分别进行连续亲和层析(SAC)实验,通过生物质谱技术鉴定差异蛋白,并利用Western Blot技术验证质谱结果的可靠性.利用RT-qPCR方法检测喹赛多孵育L-02细胞后hnRNP A2/B1 mRNA、原癌基因c-myc mRNA、细胞增殖抗原Ki-67蛋白的基因mki-67 mRNA及细胞周期基因p21、ccnd2 mRNA的表达变化.[结果]与喹赛多作用类似,2μM喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧孵育L-02细胞1h后,即可显著(p＜0.05)上调EGF mRNA的表达水平,而且将喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧作为配体与树脂基质进行偶联的效率能够达到75％以上.通过偶联得到的固定化配体捕获到5个差异蛋白,并成功鉴定3个,分别是核内不均一核糖核蛋白A2/B1 (hnRNP A2/B1)、核内不均一核糖核蛋白U (hnRNP U)以及核内不均一核糖核蛋白H(hnRNP H),均为细胞核蛋白.Western Blot结果显示,随着蛋白裂解液与固定化配体孵育次数的增加,hnRNP A2/B1蛋白丰度逐渐减小,因此说明hnRNP A2/B1蛋白是喹噁啉2-甲醛-1,4-二氧的特异性结合蛋白.2μM喹赛多孵育L-02细胞1h后,hnRNP A2/B1与mki-67基因分别出现显著性(p＜0.05)下调与上调表达.10μM喹赛多作用细胞0.5h后即可检测到mki-67 mRNA的表达水平上调显著(p＜0.05),但是细胞周期蛋白D2相关基因ccnd2 mRNA在1h时出现显著性(p＜0.05)上调表达.因此我们推测喹赛多与hnRNP A2/B1蛋白结合后,通过调控细胞增殖与细胞周期等相关基因的表达,促进细胞生长.[结论]喹赛多能进入细胞核内与靶蛋白hnRNP A2/B1结合,调节下游基因的表达,从而促进细胞生长.
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