联合应用多种细胞生长因子对真皮源性干细胞分化为神经元样细胞的影响

• 作 者: 朱珠 朱孝华
• 机 构: 南京医科大学附属南京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科 陕西省汉中市镇巴县中医院
• 出 处: 中华医学会第十八次全国儿科学术会议
• 发表日期: 2013年7期
• 关键词: 感音神经性耳聋 儿童患者 真皮源性干细胞分化 神经元样细胞 细胞生长因子

目的：内耳毛细胞作为将声波振动转换成电脉冲信号的神经终末细胞,其功能的丧失是听觉无法恢复的主要原因,也是儿童感音神经性聋防治难题的关键.联合应用毛细胞正性调控因子及干细胞移植是可能治疗该疾病的理想途径,但体内局部组织特异性的微环境决定了干细胞的可塑性,不同的诱导因素可诱导干细胞向不同类型的体细胞分化.如何使多潜能干细胞大量分化为神经元是研究的热点问题.本研究拟通过观察联合应用多种细胞生长因子逐步定向诱导,探讨对真皮源性干细胞分化为神经祖细胞样细胞的影响.方法：采用建立的改良二步酶消化法分离SD大鼠背部真皮毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs)，取稳定转染的第四代DPCs，滴加DMEM/F121:1+2％B27+20Ng/L EGF进行单细胞克隆培养，传代的真皮细胞分为诱导组(分别滴加100ng/ml NGF,20ng/ml EGF,50ng/ml IGF-I，10ng/ml bFGF,30ng/ml NT3,10ng/ml BDNF进行逐步诱导)和空白对照组(DMEM/F121:1+2％B27+20Ng/L EGF)。分别于培养6h,48h,10d在倒置显微镜下观察细胞的形态学改变，稳定诱导分化2周后免疫组化法鉴定神经细胞标记Nesin,NSE,GFAP的表达，并计算其阳性细胞率，检测真皮源性干细胞向神经元定向分化的情况。结果：诱导组经诱导6h后部分细胞胞质向核回缩，胞体开始变小，诱导48h后大部分细胞胞体明显变化，具有粗细不一的，典型的双极、多极或锥形突起，诱导分化10d后细胞胞体呈圆形或椭圆形，细胞突起细长，相互交织成网状，多为神经元样细胞。空白对照组培养10天后细胞形态无明显改变。经诱导分化2周后细胞免疫组化检测结果显示大部分诱导细胞表达Nesin和NSE，极少量GFAP阳性细胞表达，计数Nesin,NSE,GFAP阳性表达率分别为(61.9518.01)％,(29.04±10.23)％,(8.04±7.72)％;而空白对照组表达均阴性。结论:多细胞因子联合诱导方案能诱导DPCs细胞在体外向神经细胞分化，并且主要分化为神经元样细胞，其神经元的表达时间比以往研究报道的更长、更稳定，实验结果不仅提示DPCs能够成为在体外诱导增殖，并最终形成内耳毛细胞样细胞的又一新的种细胞来源，同时说明采用的逐步诱导方案能有效能模拟内耳的微环境，定向诱导多潜能干细胞向神经元分化是可能的。