PRRSV对PAMs信号转导相关基因表达的差异研究

• 作 者: 郭华 刘子臣 张书霞
• 机 构: 南京农业大学动物医学院,南京,210095
• 出 处: 2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会
• 发表日期: 2012年5期
• 关键词: 猪繁殖与呼吸综合征 猪肺泡巨噬细胞 信号转导 基因表达

目的:在体内，PRRSV的主要靶细胞是猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAM)。因此，研究PRRSV感染对猪肺泡巨噬细胞功能的影响，有助于阐释PRRSV的致病机理。
方法：本实验用包含43803个转录本的Agilent猪基因芯片技术首先筛选出PRRSV感染PAMs的差异表达基因，然后选取免疫和信号转导相关基因，用荧光定量PCR及激光共聚焦方法进行初步验证。
结果：1、基因芯片结果PRRSV感染PAMs后12小时，2倍以上差异表达基因186个，其中上调表达99个，下调表达87个；24小时差异表达2倍以上的基因2749个，其中上调表达1955个，下调表达794个。主要涉及免疫、信号转导和细胞凋亡等基因。
2、荧光定量PCR验证结果用荧光定量PCR方法对TLR4、TLR6、MyD88、NOD2等信号转导相关基因，MHC、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10和SLA-1等免疫相关基因进行验证，结果与基因芯片结果相一致。
3、激光共聚焦验证结果用激光共聚焦方法对PRRSV感染PAMs过程中病毒和NF-κB进行定位检测，结果表明，PRRSV感染后6h PAMs中就能检测到病毒，然后逐渐增多，24h病毒量最多，且阳性信号主要位于胞浆；PRRSV感染后6h的PAMs中就能看到明显的P65信号，并随着感染时间延长，P65信号逐渐增强，呈现明显的时间依赖效应；同样发生核易位的P65蛋白也随PRRSV感染时间的延长逐渐增多，说明P65蛋白在细胞内逐渐增加的同时也伴随核移位的增多。证实了PRRSV可以上调P65蛋白在PAMs中表达，并促进其发生核易位。成功构建了MyD88基因沉默的PAMs，并发现，在MyD88基因沉默的PAMs中，PRRSV感染后6h未见到P65蛋白的阳性信号，12h和24h只有极少细胞内有微弱的P65信号，到感染后36h才能见到明显的P65蛋白信号，但发生核移位的极少。初步证实了PRRSV对PAMs中NF-κB的影响受MyD88的调控。