【摘 要】
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目的：筛选微小隐孢子虫与宿主细胞黏附相关蛋白质，揭示隐孢子虫在宿主体内寄生与致病机理。 方法：参照文献提取微小隐孢子虫总RNA并分离mRNA，利用反转录酶合成cDNA，将EcoR I和H
【机 构】
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人兽共患病教育部重点实验室 吉林大学人兽共患病研究所 长春 130062
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目的：筛选微小隐孢子虫与宿主细胞黏附相关蛋白质，揭示隐孢子虫在宿主体内寄生与致病机理。
方法：参照文献提取微小隐孢子虫总RNA并分离mRNA，利用反转录酶合成cDNA，将EcoR I和HindⅢ粘性末端连到双链cDNA的两端，定向插入到T7 Select 10-3b载体，构建微小隐孢子虫子孢子蛋白质噬菌体展示文库。利用Caco-2细胞对文库进行筛选。
结果：本试验构建的微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库初始文库的滴度为5.3×105pfu/mL，文库容量为1.5×105个重组子，92％的插入片段大于0.3kb，扩增后文库滴度为3.1×1010 pfu/mL用Caeo-2细胞筛选到6个微小隐孢子虫黏附相关蛋白质。结果显示：5个蛋白质含有N端信号肽，3个蛋白质含有跨膜区，表明这几个蛋白质或分泌到虫体之外，或嵌合在虫体表膜，是可能的黏附和侵入相关蛋白质。其中编码含有跨膜区蛋白质的基因XM-625389与顶器门其它寄生虫(如疟原虫、微小泰勒虫)的相关基因具有很高的同源性，表明该基因编码的蛋白质在顶器门寄生虫中功能保守，可能是潜在的黏附和侵入相关蛋白质。通过免疫荧光将该蛋白质在虫体上进行定位，发现该蛋向质定位于子孢子表膜。另外，XM_627245和XM_627859均编码粘蛋白类相关蛋白质，而且与已报道的GP900蛋白质在结构上相类似，具有粘蛋白样模体、半胱氨酸和苏氨酸富集模体，并具有O-糖基化位点。预测这两个蛋白质可能具有与GP900蛋白质相似的黏附功能。
结论：成功构建了微小隐孢子虫噬菌体展示文库，用Caco-2细胞对文库进行筛选，共筛选到6个微小隐孢子虫黏附相关蛋白质，其中1个为微小隐孢子虫重要的表面黏附蛋白质CP2，另外5个可能的黏附相关蛋白质的功能尚需进一步鉴定。
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